RT-qPCR检测原理
逆转录实时定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）将逆转录反应（RT）与实时荧光聚合酶链式反应（qPCR）相结合，是当下病原学分子诊断的常用方法。RT-qPCR以RNA为起始材料，在RT阶段，运用逆转录酶以RNA为模板形成互补的DNA链（cDNA）。随后以cDNA为模板进行qPCR反应。RT-qPCR已被用于多种分子生物学的应用中，其中包括病原体检测、基因测试、疾病研究和基因表达分析。
1.RT-qPCR的一步法与两步法
1）一步法：将逆转录与PCR扩增结合在一起，使逆转录酶与DNA聚合酶在同一管内同样缓冲液条件下完成反应。由于两步反应都在一个管中完成，因此该方法具有更少的实验误差和移液步骤，减少污染的风险。
2）两步法：将逆转录和PCR扩增过程分开，在两个管中完成检测。需要使用不同的缓冲液、反应条件、以及引物设计策略。由于反应分步进行，能够优化单一反应过程的反应缓冲液和反应条件，可建立长期保存，并用于多次反应的稳定cDNA库。
| 优点 | 缺点 | |
| 一步法 | 更少的实验误差 | 无法分别对两步反应进行优化 |
| 减少污染风险 | 减少污染风险 | |
| 可进行高通量扩增或筛选 | 可进行高通量扩增或筛选 | |
| 两步法 | cDNA可保存并用于多次反应 | 污染风险增加 |
| 优化单一反应条件和缓冲液 | 操作复杂，实验误差增大 | |
| 灵敏度高 | 需要进行更多的优化 |
表1. 一步法与两步法对比
2.RT阶段
RNA是逆转录的模板。根据来源材料的类型和实验目标，有多种方法可进行RNA的提取。较常用的有Trizol法、离心柱法和磁珠法。在RT阶段，引物在退火时与单链RNA结合，提供给逆转录酶一个用于合成的起点位置。逆转录酶利用RNA合成cDNA，得到稳定的RNA-DNA杂交链。
引物可分为三种引物Oligo引物（dT）、随机引物和序列特异性引物。Oligo引物（dT）包含锚定位点，确保引物结合至mRNA 3'端poly(A）尾部。随机引物长度6-9个碱基，在RNA转录过程中，可退火至多个位点，提高cDNA产量。序列特异性引物是靶向特异的RNA序列的定制引物，可产出特异的cDNA库。通常情况下将Oligo引物与随机引物混合使用为逆转录酶提供结合位点。当检测RNA病毒时需要使用序列特异性引物，结合在靶标序列上。
逆转录酶需要具有较高热稳定性和较低核糖核酸酶H（RNase H）活性。较高热稳定性可以保证逆转录酶在整个反应中的活性来获得更高的 cDNA 产量，减少非特异性扩增。较低的RNase H活性可以减少RNA的降解来避免截短cDNA。
3.qPCR阶段
1）染料法：加入一对引物和SYBR GreenⅠ荧光染料。退火阶段，引物特异性结合在两条链上，为DNA聚合酶提供结合位点。SYBR GreenⅠ荧光染料是一种DNA双链小沟结合染料，DNA聚合酶延伸引物，形成双链，染料结合于双链小沟中发出荧光。反应体系内双链DNA浓度越高荧光信号越强。由于染料法无法在同一个反应中检测多个目的片段，还会受到引物二聚体的影响。在这种情况下，需要进行熔解曲线分析，判断扩增所得产物是否只有一种。
图1. 染料法发光原理
2）探针法：将荧光染料替换为一条Taq Man探针。探针具有与靶标互补的序列，5'端标记一个荧光报告基团，3'端标记一个荧光淬灭基团，当探针完整时，荧光信号会被淬灭基团吸收。退火阶段，探针特异性结合到靶标序列上，DNA聚合酶沿5'-3'方向合成新链直至探针 5'端时，聚合酶水解探针，使荧光报告基团与淬灭基团分离，产生荧光。3'端淬灭基团阻止探针被DNA聚合酶扩增。Taq Man探针结合的目标越多，荧光信号越强。理论上，探针法中的荧光只来源于靶标，也就是不受非特异性扩增和引物二聚体影响。
图2. 探针法发光原理
4.结果分析
1）熔解曲线：当扩增完成后，对反应体系进行升温检测，同时监测荧光信号。当到达某一温度后，双链DNA迅速解链，荧光信号骤降。当信号达到最低时，即可获得荧光信号强度随温度变化的原始图谱。对原始图谱进行负导数转换，绘制荧光信号变化与温度的关系图，图中峰值对应的温度即为Tm值。基于Tm值的差异，便可区分产物。
熔解曲线一般用于染料法，出现单峰说明扩增产物特异性好；出现杂峰特异性差，存在非特异性扩增。若熔解曲线只有单峰且对应温度是退火温度则是靶标发出的荧光，实验结果有效。
图3. 染料法熔解曲线
2）扩增曲线：将已知浓度的靶标稀释几个数量级后进行qPCR反应循环扩增，并用产生的荧光信号与相应浓度生成标准曲线。将未知样本的Ct值与该标准曲线进行比对，可以确定其浓度。
荧光阈值是PCR 3-15个循环荧光信号标准差的10倍（荧光阈值要设定在PCR扩增的指数期）。qPCR的扩增曲线与荧光阈值交点对应的横坐标就是循环数（Ct）值。Ct值越低证明样本中靶标越多。从qPCR的曲线中可以看出，在基线期，没有明显的荧光信号。随着循环数的增加，荧光信号逐渐增强。在平台期，因酶活降低或dNTP被消耗殆尽，曲线趋于平缓。
图4. qPCR扩增曲线
参考文献
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[4]Kulesh D A, Loveless B M, Norwood D, et al. Monkeypox virus detection in rodents using real-time 3'-minor groove binder TaqMan assays on the Roche LightCycler.[J]. Laboratory Investigation, 2004, 84(9): 1200-1208.
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