荧光免疫层析工艺流程

荧光免疫层析技术（FICA）是基于抗原抗体反应和层析现象的新型膜检测技术。相较于胶体金技术，荧光免疫层析技术有着可定量分析和高灵敏度等特点，与此同时在试纸条制备上也有着更高的操作要求。简单为大家介绍一种荧光免疫层析工艺流程（仅供参考）

抗体标记

1. 清洗

检查荧光微球溶液外观，确保无凝聚、无漂浮物等变质情况。将荧光颗粒吹打混匀，量取50ul（0.5mg），加入至2ml干净、已烘干的圆底离心管中，加入500ul清洗液吹打混匀，低温16000r/min离心10min除去上清。

2. 活化

用活化液分别配制EDC溶液和NHS溶液各5ul（0.1mg）。取190ul活化液重悬荧光微球，吹打混匀。分别加入上述EDC溶液和NHS溶液成200ul体系，吹打混匀，水浴超声5min。37℃，200r/min振荡孵育30min后低温16000r/min离心10min除去上清，分别用300ul和500ul活化液重悬、离心清洗一次。

3. 偶联

在活化、清洗后的荧光微球中加入一定体积的标记液（V=抗体标记体系体积200ul-标记抗体体积）重悬微球，加入标记抗体0.05mg（由浓度换算成体积），吹打混匀，水浴超声5min后37℃恒温振荡16000r/min*3h。

4. 封闭

加入已对半稀释的200ul0.125%封闭液吹打混匀，水浴超声5min后37℃，100r/min恒温振荡30min；再加入已对半稀释的400ul0.063%封闭液吹打混匀，水浴超声5min后37℃，100r/min恒温振荡30min。

5. 保存

低温14000r/min*10min离心除去上清，加入100ul室温保存液重悬（微球终浓度5mg/ml，抗体终浓度0.5mg/ml），吹打混匀。

处理结合垫

根据需要使用含不同组分（表面活性剂、封闭剂、保护剂）的缓冲液处理包被PVA的玻纤，37℃烘干。

缓冲液如：磷酸缓冲液、Tris、硼酸缓冲液、碳酸缓冲液、生物缓冲液等；

表面活性剂如：Tween-20、Tritonx-100、S9等；

大分子（封闭、保护）如：PEG4000、PEG20000、PVP、PVA等；

小分子（保护）如：糖类物质（蔗糖、海藻糖等）；

惰性蛋白（封闭）如：BSA、OVA、Casein、Casein-Na等。

喷涂标记抗体

根据项目检测特点用保存液稀释标记抗体-微球至合适浓度，选择性使用独立质控抗体一同喷涂在标记垫上；设置划膜喷金仪喷涂参数，预实验建议为2ul/cm，在结合垫上喷涂标记抗体，37℃烘干4h。

划线包被抗体

根据项目检测特点选择合适的包被抗体浓度，根据项目及所用抗体情况选择C线的二抗，设置喷涂参数。预实验建议为1ul/cm，划线后37℃过夜烘干。

组板

将吸水垫和制备好的标记垫、样品垫贴在硝酸纤维素膜上，根据检测卡壳卡槽大小裁剪试纸条。

包装

将裁切好的检测条压入检测卡壳内。

注意事项

1.荧光微球清洗后上清液应该保证澄清，不应该浑浊；
2.EDC溶液和NHS溶液要先配现用，配好的溶液应无团聚；
3.超声过程中液体会溅到管壁上，需要间断地轻甩离心管；
4.偶联加入抗体时应无颗粒状沉淀产生；孵育时每隔半小时观察是否有沉淀产生，如有，可水浴超声5min；
5.标记完成后4℃保存，过夜后观察应无沉淀。
6.项目不同、检测指标要求不同，工艺需要做适当调整，可参考免疫层析工艺常见问题及解决方法。