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糖化血红蛋白(HbA1c)的检测方法

全球糖尿病(DM)患病率很高,是严重威胁人类健康的世界性公共卫生问题,DM的防治一直是医学研究的热点。传统的DM诊断和治疗检测采用空腹血糖(FBG)、餐后血糖(OBG)和口服葡萄糖耐量实验(OGTT)等,但是血糖参数仅代表抽血时的瞬间血糖水平,而糖化血红蛋白(GHb)作为反映长期血糖水平的金标准,也是检测DM治疗的重要指标。1985年Allen等报告用阳离子交换层析仪把人类HbA分离成至少3种比HbA带更多阴电荷的较小成分,按照从柱中洗涤出来的顺序先后把它们分别称为HbA1a、HbA1b和HbA1c。但当时并没有发现这些成分与DM之间的关系。直到1975年,人们才逐渐认识到HbA1c来源于葡萄糖结合经翻译修饰后的HbA,以及HbA1c与FBG、葡萄糖耐量试验中的葡萄糖峰值以及曲线下面积、过去数周的平均血糖水平等之间的密切关系。本文主要对HbA1c的检测方法做一介绍。
临床实验室常用的HbA1c分析方法分为两大类:一类基于HbA1c和非HbA1c所带的电荷不同,包括阳离子交换层析法。电泳法和等电位聚焦法;另一类基于GHb基团结构不同,包括亲和层析法和免疫学方法。

1. 乳胶凝集反应法

乳胶凝集反应法是利用糖化血红蛋白(HbA1c)抗原与HbA1c抗体直接测定总血红蛋白Hb中的糖化血红蛋白(HbA1c)的百分含量。目前国内外几家厂商可以提供HbA1c测定的试剂盒。这种免疫反应是由被测血样品种的总Hb和HbA1c与试剂中的HbA1c抗体结合而形成凝集,凝集量随HbA1c蛋白浓度的大小而变化。用生物分析仪器来进行比浊测定HbA1c抗原的浓度,采用终点法,生化仪通过测定反应液的吸光度值,可直接反映出凝集量的多少;推算出HbA1c占Hb的百分含量,测定时,仪器多采用660nm单色光做主波长,800nm单色光做副波长,通过标准曲线得出实测值。由于这种试验其标准曲线是非线性的,所以在测定前,首先用随试剂盒一起带有的5种不同浓度的定标液,做出5点非线性标准曲线。曲线和数值存在生化仪的贮存器中,测定样品时,实测出的吸光度值A与标准曲线比较,由仪器CPU求出实测样品中的HbA1c百分含量。乳胶凝集反应法测定HbA1c方便、不用增加仪器,可直接用自动生化分析对样品进行快速测定。该方法也可以用手工的方法,在酶标仪进行测定,是目前使用较多的方法。但乳胶凝集反应法其准确性和重复性均有欠缺。

2. 离子交换高压液相色谱法HPLC

使用离子交换高压液相色谱HPLC(high pressure liquid chromatography)来测定糖化血红蛋白(HbA1c)的百分含量目前被认为是分析HbA1c的金标准。采用HPLC方法工作的全自动糖化血红蛋白分析仪器,仪器快速、简便、精巧、准确等特点,受到越来越多用户的欢迎。

色谱分析是一类利用混合物的各组分在不同相上的分配差别,在两相物质相对运动过程中,将混合物中的各种成分分离开的一种分析技术。液相色谱是以液体或固体为固定相,以液体为液相的色谱法的总称。色谱法又叫色层或层析,这一技术在生命科学研究中用于生物活性物质的分析;生物活性物质是以混合物形式存在,人类血液中的蛋白质有上千种,只有把混在一起的被测蛋白分离出来,才能准确测定;在HbA1c的测定时,可以通过高精度HPLC,将HbA1c从Hb中分离出来,才能得到准确的数值。在生命科学研究中,活性物质的分离主要应用的是液相色谱。

3. 糖化血红蛋白自动分析仪

糖化血红蛋白自动分析仪采用离子交换HPLC法测定糖化血红蛋白(HbA1c)。离子交换HPLC法,是利用能交换离子的材料为固定相来分离离子型化合物的方法。仪器使用阳离子交换柱进行HbA1c的百分比测定;当一定量的全血样品被取样针吸入到进样装置内,在稀释部分被溶血释放出红细胞中的血红蛋白Hb,并由稀释液稀释,稀释好的已经溶血的样品,由高压泵注入离子交换柱。柱内的固定相是最新研发的非多孔性、不溶和可渗透的交联高聚物,上面分布固定的带电荷基团和能游走的配衡离子;样品通过过滤器从交换柱顶端加入后,由三种不同浓度的盐洗脱缓冲液(流动相)洗脱,使样品向下移动。此时溶液中所含血红蛋白Hb的各种组分即与固定相上能移动的离子进行交换,样品中的血红蛋白多种组分在固定相上连续进行可逆的交换吸附和解吸作用,而3种不同离子浓度的盐液,形成线性梯度洗脱。全自动血红蛋白分析仪能在1分多钟内,将Hb中的多种成分分离,其中HbA1c、HbF、HbA1被有效、精确的分离;由交换柱流出的Hb成分到达仪器的检测器,检测器内装有发射单色光的发光二极管,通过双波长可见光比色法测定HbA1c、HbF、HbA1三个参数。仪器的检测器检测出分离后HbA1c、HbF、HbA1组分的吸光度值,与HbA1c标准品吸光度值比较,分析计算出结果,最后以百分率表示的Hb组分结果与色谱图一起打印出来。

离子交换柱HPLC法对全血直接测定HbA1c,其批内和批间变异系数CV均可以小于1%,结果精确,HbA1c检测结果不受存在的变异型血红蛋白及其衍生物的影响,特别适合糖尿病人的监控。

4. 金标免疫渗滤法(金标法) 免疫渗滤法

操作较简便, 目前代表仪器有挪威NycoCardReaderII特种蛋白多功能全定量金标检测仪。

5. 化学发光法

采用离子捕捉免疫分析法, 应用HbA1c抗原与HbA1c抗体反应原理, 联以荧光标记物, 通过连接带负电的多阴离子复合物, 吸附到带正电的纤维表面, 经过一系列彻底清洗等步骤后, 测定荧光强度变化率, 计算浓度。采用专用试剂包和免疫发光分析仪,其检测系统易于规范和重复, 可减少操作技术误差, 检测的灵敏度和特异性高, 批内、批间变异系数小, 回收率高, 准确度高, 交叉污染率小, 影响因素少。

6. 放射免疫法

优点: 精密度高、特异性强、快速、价格相对便宜, 可批量测试, 且不受各种干扰因素的影响。缺点: 目前对制备高效价的抗体尚存在许多困难, 仍处于研究中, 未能形成商品化试剂盒。

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