化学发光免疫分析——磁珠性质与应用
化学发光免疫分析（CLIA）以高灵敏度闻名，可在低浓度下检测分析物，在宽动态范围内提供良好检测限。免疫磁珠（Immunomagnetic Bead，IMB）具有操作简便、分离效率高、比表面积大及物理稳定性良好的优点，是一种性能优良的磁性分离载体，是纯化、检测和定量分析复杂分析物的通用工具。磁珠作为固相载体与CLIA相结合，在外加磁场的作用下，能够快速与底物液相分离，磁珠以其高效分离和富集作用在免疫分析反应中使抗原对磁珠上固定化抗体的影响显著降低。
磁珠作为免疫反应和信号收集载体的优势：
1）磁珠比表面积大，能结合更多的蛋白分子，可提高检测范围。
2）磁珠表面化学基团与蛋白形成共价偶联，相对于物理吸附更牢固，更稳定。
3）磁珠均匀悬浮于反应溶液中，大大增加与样本中待测物接触面积，减少反应所需的样本量，同时更快达到反应动态平衡，加快反应速度，节省反应时间。
4）将连有多种捕获蛋白的磁珠与多标记技术联合应用，实现同一样本中多个待测物同时检测，实现全自动个体化检测。
1.磁珠种类及结构
1.1 常见磁珠种类
1）羧基磁珠（Carboxyl Mag）
Carboxyl羧基磁珠是一种化学发光试剂用高性能磁珠，羧基官能团用于蛋白或核酸偶联，在酶免测定、免疫沉降、蛋白质印记解析时能够发挥突出性能。
2）甲苯磺酰基磁珠（Tosyl Mag）
因磁珠涂层中含有甲苯磺酰基，含有氨基的抗体等分子无需羧合剂，可直接以化学结合的方式固定在磁珠表面
3）链霉亲和素磁珠（Streptavidin Mag）
磁珠偶联链霉亲和素能对生物素标记的分子进行高纯度的特异性吸收，且磁珠表面亲水性聚合物涂层不会对酶促反应、PCR核酸扩增产生影响。
1.2 结构
磁珠结构一般由磁性内核、包裹在外的高分子涂层及功能基层构成。在外部磁场作用下，磁珠在磁场中做定向运动，辅以微控制和检测手段，可实现磁珠定位和介质分离。
Fig 1. 磁珠结构（图片参照文献Aptamer-Modified Magnetic Beads in Biosensing）
1）内核：主要由纯金属（如钴、镍和铁）或其氧化物等磁性材料组成，此外还可采用CoPt3、FeCo和FePt等磁性材料。
2）高分子涂层：材料一般为聚苯乙烯、聚氯乙烯，主要用于稳定新形成的磁珠表面和防止磁珠聚集。高分子涂层可以与多种活性物质结合，如抗原、抗体、核酸等。
3）功能基层
蛋白质或抗体偶联磁珠表面的稳定性主要取决于表面性质。当磁珠表面无修饰时，抗体通过疏水相互作用被动吸附到磁珠表面。这种方式不能控制附着分子的最终方向，也无法保证捕获分子的特异性和稳定性。为确保偶联稳定性与捕获特异性，可选择化学修饰表面与生物修饰表面。
化学修饰表面：
-
① 经典化学修饰表面：抗原或抗体直接被动吸附于化学修饰磁珠表面。活性基团利用磁珠的表面积为抗原或抗体提供大量位点，使其与磁珠共价连接。添加到表面的经典基团有羧基、氨基、羟基和硫酸盐。
Table 1. 磁珠经典化学修饰及活化方式磁珠化学修饰 活化方式 羧基修饰 添加碳二亚胺（EDC）、N-羟基丁二酰亚胺（NHS）
或磺基NHS和乙基（二甲氨基丙基）进行活化氨基修饰 激活蛋白质表面羧基 羟基修饰 在非水溶液中活化，以避免中间体水解 -
② 预活化修饰表面：分子连接到表面预活化修饰磁珠之前无需进行初步激活，在适宜缓冲液、pH和温度条件下即可形成稳定共价偶联。
Table 2. 磁珠预活化修饰及结合基团磁珠预活化修饰 结合基团 甲苯磺酰基（Tosyl）修饰 中性pH值：结合蛋白质巯基；
偏碱性pH值：结合氨基。环氧基团修饰 pH值稍偏碱性：结合硫醇基团；
较高pH值：结合氨基；
强碱性pH值：结合含羟基的配体。氯甲基修饰 室温中性pH值：结合氨基
生物修饰表面（表面生物功能化）：
生物功能化磁珠由于其超顺磁性被广泛用于捕获特定分子或细胞。生物修饰与化学修饰不同，生物修饰以非共价方式连接分子。在生物技术领域生物功能化磁珠通常用于蛋白质/分子纯化等分离过程，在体外诊断试剂中作为固相载体。
- ① 蛋白A或G以非常高的亲和力结合某些免疫球蛋白亚型。蛋白A结合大多数Ig的Fc区，蛋白G结合Ig的Fc或Fab区，可用于固定抗体；
- ② 链霉亲和素具有极高亲和力，链霉亲和素与生物素之间的结合可承受高温、大范围pH值等极端条件。
| 功能基层 | 作用方式 | 优点 | 缺点 |
| 无 | 磁珠与抗体被动偶联 | 便宜 | 易出现大量非特异性结合，产生高背景值 |
| 化学修饰 | 磁珠通过表面-COOH、-NH2、 -OH、-SH等化学修饰基团与抗体共价偶联 |
表面修饰简单，偶联稳定 | 易出现聚合和非特异性结合 |
| 生物修饰 | 磁珠通过表面链霉亲和素、抗IgG、蛋白A或G等生物修饰与抗体非共价偶联 | 生物磁分离，无需额外洗涤；可承受高温等极端条件 | 价格昂贵 |
2.免疫磁珠作用原理及应用
2.1 原理
磁珠一般具有超顺磁性，在磁场作用下实现结合、未结合蛋白快速分离，简化操作，缩短反应时间。磁珠表面通过外部修饰的功能基团结合活性蛋白，作为抗原抗体反应的载体。磁珠作用方式分为直接作用和间接作用两种，直接作用是用抗体/抗原包被磁珠直接与特异性抗原/抗体物质结合后，形成磁珠-免疫复合物。间接作用是用二抗包被磁珠，抗原与一抗进行孵育，再加入二抗偶联的磁珠，形成磁珠-二抗-一抗-抗原复合物。复合物具有强磁响应性，在磁力的作用下定向移动，使复合物与液体中其他物质分离，达到分离、浓缩、纯化特异性蛋白的目的。
Fig 2. 磁珠作用原理
2.2 应用
免疫磁珠固相化抗原或抗体在免疫检测、细胞分离、生物大分子纯化、分子生物学等方面得到了广泛应用。免疫磁珠还可用于临床靶向药物递送、磁共振成像和细胞间热疗靶向破坏肿瘤。
1）免疫检测
在免疫检测中，免疫磁珠作为固相载体，抗体与抗原在磁珠上特异性结合，形成抗原-抗体复合物，在磁力作用下，使特异性抗原与其它物质分离。这种次磁性分离具有灵敏度高、检测速度快、特异性高、重复性好等优点。磁珠还可通过极性现象来检测表面分子、判断细胞类型，可用于激素、神经递质、细胞因子、肿瘤相关抗原等物质的检测。
2）细胞分离
运用磁珠和抗体可在磁场作用下进行细胞分离，广泛应用于：
- ① 体液中少量肿瘤细胞检测，提高肿瘤早期诊断率；
- ② 快速高效分离T、B细胞，用于器官移植中HLA组织分型；
- ③ 骨髓移植物的预处理，提高移植成功率；
- ④ 各种医疗、科研项目特定细胞成分的分离或清除。
3）生物纯化
磁珠可作为微型配基载体，在基质上固相化抗原或抗体，形成特异性吸附，再进行磁性亲和抽提，不需离心和过滤。可用于分离纯化大分子、DNA、RNA、DNA结合蛋白、mRNA等物质。
4）分子生物学应用
磁珠借助亲和素-生物素系统可与非蛋白质结合，用磁珠固相分离单链法，可直接对PCR双链产物进行分离或对其单链进行测序。
参考文献
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