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化学发光免疫分析平台

发光是指分子或原子中的电子吸收能量后,由基态(较低能级)跃迁到激发态(较高能级),然后在返回到基态并释放光子的过程。根据形成激发态分子的能量来源不同发光可以分为光照发光、生物发光、化学发光。

化学发光(chemiluminescence,CL)是指伴随化学反应过程所产生的光的发射现象。反应体系中的某些物质分子,如反应物、中间体或者荧光物质在进行化学反应时,由于吸收了反应时产生的化学能,使反应产物分子激发至激发态,受激分子由激发态回到基态时,便发出一定波长的光。化学发光分析方法主要是依据化学发光检测体系中待测物浓度与体系的化学发光强度在一定条件下呈线性定量关系的原理,利用仪器对体系化学发光强度进行检测,而确定待测物含量的一种痕量分析方法。

1977年,Halman等将化学发光与抗原抗体免疫反应相结合,创建了化学发光免疫分析方法(chemiluminescent immunoassay,CLIA),相较于传统免疫技术(放射免疫技术、酶免疫技术、荧光免疫技术等),CLIA具有自动化程度高、特异性好、精确度高、检测范围广等优势。

化学发光免疫分析方法类型及其原理

CLIA包含两个部分,即化学发光分析系统和免疫反应系统。化学发光分析系统是利用化学发光物质经催化剂的催化和氧化剂的氧化,形成一个激发态的中间体,当这种激发态中间体回到稳定的基态时,同时发射出光子(hν)利用发光信号测量仪器测量光量子产额。免疫反应系统是将发光物质(在反应剂激发下生成激发态中间体)直接标记在抗原或抗体上,或酶作用于发光底物。化学检测系统通过光电信号检测仪检测发光强度,最后通过化学发光标记物与发光强度的关系确定被测物的含量。

CLIA根据标记物的不同可分为三大类,即直接化学发光免疫分析、酶促化学发光免疫分析和电化学发光免疫分析。

直接化学发光

化学发光剂直接标记抗体或抗原的免疫测定方法称为化学发光免疫分析。直接化学发光剂在发光免疫分析过程中不需要酶的催化作用,直接参与发光反应,他们在化学结构上有产生发光的特有基团,可直接标记抗原或抗体,目前常见的直接化学发光标记物主要有吖啶酯类化学发光剂。
直接化学发光

用吖啶酯直接标记抗体,与待测标本中相应的抗原发生免疫反应后,形成固相包被抗体-待测抗原-吖啶酯标记抗体复合物,这时只需加入氧化剂(H202)和NaOH使成碱性环境,吖啶酯即可在不需要催化剂的情况下分解、发光。由集光器和光电倍增管接收、记录单位时间内所产生的光子能,这部分光的积分与待测抗原的量成正比,可从标准曲线上计算出待测抗原的含量。

直接化学发光速度快、试剂稳定性好,但灵敏度略低于酶促发光。

酶促化学发光

酶促化学发光免疫分析(chemiluminescentenzymeimmunoassay,CLELA)是以酶标记抗原或抗体进行免疫反应,免疫反应复合物上的酶再作用于发光底物,在信号试剂作用下发光,用发光信号测定仪进行发光测定,酶的浓度决定了化学发光的强度。辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(ALP)为化学发光酶免疫分析常用的标记酶,发光底物以鲁米诺、AMPPD为代表。

发光物质 激活酶 特点
鲁米诺及其衍生物 HRP 闪光型,在使用增强剂的情况下,发光的持续时间可延到30~60min,强度至少增加100倍以上。
通常采用Luminol/H2O2/HRP体系,化学发光反应2min后,光反射强度达到最高峰;20min后,光强度减少20%
AMPPD ALP 在碱性环境下,AMPPD本底低;
热稳定性好,在pH=7.0的水中,30℃时的分解半衰期为142h;
发光为辉光型,波长为470nm,在15min时强度达到高峰,15~60min内光信号强度维持一致,变化很小;
加入增强剂能明显增强发光强度,达100~100,000倍

鲁米诺+HRP发光体系

HRP-CLEIA体系具有发光时间短(几秒内瞬时闪光),发光强度低、不易测量等缺点,为了解决这一问题,通常在发光系统中加入发光增强剂。发光增强剂主要作用为放大光输出,增强光信号,提高发光持续性,从而提高分析灵敏度和可重复性。

该分析系统采用辣根过氧化物酶(HRP)标记抗体,在与反应体系中的待测标本和固相载体发生免疫反应后,形成固相包被抗体-待测抗原-酶(HRP)标记抗体复合物,这时加入鲁米诺发光剂、H2O2和化学发光增强剂使产生化学发光。

鲁米诺+HRP发光体系

ALP+AMPPD发光体系

碱性磷酸酶(ALP)和1,2-二氧环己烷构成的发光体系是目前最重要、最灵敏的化学发光体系,其中最具代表性的是ALP-AMPPD发光体系。该反应体系以碱性磷酸酶标记抗体,在与反应体系中的待测标本和固相载体发生免疫反应后,形成固相包被抗体-待测抗原-酶标记抗体复合物,这时加入AMPPD发光剂,碱性磷酸酶使AMPPD脱去磷酸根基团而发光。

ALP+AMPPD发光体系

电化学发光免疫分析

在电极上施加一定的电压或电流时,在电极电化学反应产物之间或电极反应产物与溶液中某种组分之间发生化学反应而产生激发态,当激发态跃迁回基态时放出能量,此过程即为电化学发光(electrochemiluminescence,ECL)。电化学发光免疫分析(electrochemiluminescenceimmunoassay,ECLIA)是以电化学发光剂三联吡啶钌标记抗体,以三丙胺(TPA)为电子供体,在电场中因电子转移而发生特异性化学发光反应,它包括电化学和化学发光两个过程。

电化学发光免疫分析

在电化学发光免疫分析系统中,磁性微粒为固相载体包被抗体,用三联吡啶钌标记抗体,在反应体系内待测标本与相应的抗体发生免疫反应后,形成磁性微粒包被抗体-待测抗原-三联吡啶钌标记抗体复合物,这时将上述复合物吸入流动室,同时引入TPA缓冲液。当磁性微粒流经电极表面时,被安装在电极下面的电磁铁吸住,而未结合的标记抗体和标本被缓冲液冲走。与此同时电极加压,启动电化学发光反应,使三联吡啶钌和TPA在点击表面进行电子转移,产生电化学发光,光的强度与待测抗原浓度成正比。

三种化学发光免疫分析方法的比较

  直接化学发光 酶促化学发光 电化学发光
标记物 吖啶酯 HRP 三联吡啶钌
反应类型 夹心法、竞争法 夹心法、竞争法 夹心法、竞争法
光信号 闪光 辉光 电激发闪光
简便快速 快速 较快速 快速
影响结果的因素 较多
可否半自动开放 可以
检测成本
发光底物 NaOH 金刚烷、普米诺 电激发

化学发光、时间分辨荧光、酶免疫分析对比

  化学发光 时间分辨荧光 酶免疫分析
示踪物 吖啶酯、酶、三联吡啶钌
测量信号 单光子 荧光 比色
最小检出值 10-15mol 10-15mol 10-9mol
可否提高灵敏度 可以 可以
完成操作流程
成本 较高
试剂盒有效期 半年到更长 1年 半年

临床应用

CLIA具有特异性强、灵敏度高、准确、操作简单、快速等优点,它将化学分析方法和免疫学分析方法的优点融合了起来,已经被广泛用于生命科学、环境科学、临床医学和生理学等领域。常见的临床医学应用有:

甲状腺激素检测;
生殖激素检测;
垂体激素和皮质激素检测;
贫血因子检测;
肿瘤标志物检测;
感染性标志物检测;
感染性疾病;
糖尿病、胰岛素、血清C-肽、血浆胰高糖素等;
心脏标志物检测;
病毒标志物检测;
过敏性疾病;
治疗药物检测;

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