新冠中和抗体原理及检测
谈“毒”色变是人类对于病毒一直以来的态度,从埃博拉到SARS,再到如今的2019新型冠状病毒(SARS-CoV-2),无不对人类健康产生了巨大威胁。了解病毒的入侵机制对于研究相应治疗方案必不可少。SARS-CoV-2病毒中有个重要的棘突S蛋白(spike protein),S蛋白是一类由S1/S2异二聚体组成的三聚体跨膜糖蛋白,可识别宿主细胞受体-血管紧张素转换酶2(ACE2)并介导膜融合,其含有的一个C端受体结合域(RBD)更是直接参与了宿主受体的识别,介导病毒入侵宿主细胞。
中和抗体
免疫系统在经受病毒刺激后会产生相应的抗体,有些抗体可以和病毒颗粒结合,阻止病毒感染细胞,以此把病毒“中和”掉了,这些抗体就称为“中和抗体”。也就是说,中和抗体实际上是普通抗体的一种。我们正常所说的抗体是指病毒入侵后机体产生的抗体的统称,它包含针对不同病毒识别表位产生的多个抗体,大部分抗体是通过向T-淋巴细胞发出锁定抗原的信号,激发细胞免疫反应,杀死病毒,而中和抗体则是特异针对病毒中和表位产生的抗体,可直接靶定到病毒中和表位,使病毒失去结合受体的能力,这一过程不需要激活T-淋巴系统。同时研究发现不同结合表位的中和抗体活性也存在差异,其中与病毒中和表位完全吻合的中和抗体活性最好,与病毒中和表位有差异但存在一定覆盖的中和抗体活性显著降低。
在新冠疫情大肆蔓延的背景下,国家科学技术部发布了《新型冠状病毒中和抗体产品研发应急项目申报指南》,申报指南指出中和抗体具备阻断病毒侵染目的细胞的潜力,且单克隆抗体具有作用机制明确、易于大规模产生的优点,是新冠病毒治疗药物研究的重点方向。科学家们纷纷将目光投向了新型疗法---中和抗体疗法。近期由清华大学和深圳国家感染性疾病临床医学研究中心合作,成功从新冠感染者外周血单核细胞中分离出了表达抗体的B细胞,并在人体外实现了抗体表达,获得了2株中和功能较好的单克隆抗体。这种单克隆抗体抗体便是能特异性结合RBD蛋白,并有效阻断病毒与宿主细胞受体ACE2蛋白结合的新冠中和抗体。
2019新型冠状病毒(2019-nCoV)中和抗体的检测方法
新冠中和抗体的检测可以反映群体的感染率、个人的康复情况以及疫苗的效果,但传统的病毒中和实验需使用活病毒和细胞,且对实验室安全性及操作人员技能要求较高。这种耗时长、要求高的传统中和检测方法显示不适用于传播速度快、感染覆盖范围广的新冠疫情。因此,衍生出了几种无需使用感染性病毒、快速检测新冠中和抗体的方法。
一、酶联免疫吸附法(ELISA)检测
该方法利用新冠病毒蛋白结合结构域RBD抗原和受体蛋白ACE2抗原之间的结合,模拟病毒与宿主细胞的相互作用,通过显色反映判断病毒感染情况,但当中和抗体存在时,便会阻断蛋白互作,显色反应减弱。
二、胶体金试纸条
胶体金平台利用竞争法检测中和抗体,RBD抗原用胶体金标记并固定在结合垫上,ACE2抗原固定在NC膜的T线上,能与胶体金标记RBD抗原特异结合的抗体固定于NC膜的C线上。当待测样品中有新冠中和抗体时,中和抗体会和RBD抗原结合,降低了RBD和ACE2的结合效率,T线显色度显著下降。
三、hiVNT系统
“hiVNT系统”依赖于一个人为改造的生物发光报告基因NanoLuc荧光素酶,NanoLuc可切分成两个亚基,分别是11aa的小亚基HiBiT和156aa的大亚基LgBiT,两个亚基分开时不具有发光活性,但是融合后又能恢复荧光素酶的活性。 “hiVNT系统”检测新冠中和抗体就是通过组合表达S蛋白和带HiBiT标签的病毒样颗粒VLP,当S蛋白与VeroE6/TMPRSS2细胞表面ACE2受体结合后,VLP膜与宿主细胞膜融合,衣壳蛋白被吸收到细胞中后,HiBiT与宿主细胞中稳定表达的LgBiT蛋白相互作用形成NanoLuc荧光素酶,如果同时添加含中和抗体的血清(如新冠康复期患者的血清),NanoLuc荧光素酶的发光强度显著下降,该检测方法可以作为评价新冠治疗效果的依据。
目前这几种新冠中和抗体检测方法都兼具快速、高通量的特征,可针对性地检测干预治疗后新冠患者体内的中和抗体数量,作为疫苗有效性的检测标准,为后期新冠疫苗大规模筛选提供最合适、最快速的检测方法学。
参考文献
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