化学发光标记技术及影响因素
化学发光标记技术按照标记反应的过程和形成结合物的结构特点，可分为直接偶联和间接偶联两种方式。直接偶联是指通过偶联反应使标记物分子中的反应基团直接连接在被标记物分子的反应基团上。间接偶联的特点是在标记物与被标记物之间插入一条链或一个基团，使两种物质通过引进的“桥”连接成结合物。通过插入“桥”可以在原有的结构中引进新的活性基团、增加反应活性，还可以减弱参与偶联双方存在的空间阻碍效应。小分子物质结合物主要通过偶联反应制备；大分子物质结合物主要交联剂使标记物与被标记物结构中的游离的氨基、羧基、咪唑基、酚基、羟基等形成不可逆连接。
常用的标记技术有以下几种：
1.碳二亚胺缩合法
水溶性碳二亚胺成功的用于制备大分子-大分子或大分子-半抗原衍生物的交联结合物。经过碳二亚胺缩合反应，蛋白质分子中的游离羧基能与发光剂分子中的氨基形成较为稳定的酞胺键。反应条件比较温和，应用范围广。结构中含有羧基或氨基的标记物均可选用此方法进行标记。可供使用的缩合剂有：二环己基碳二亚胺（DCC）、1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）-碳二亚胺-HCI（EDC）等。
2.重氮盐偶联法
此法也称为“重氮化法”是在酸性和低温条件下，用亚硝酸盐将发光剂的伯氨基重氮化得到重氮盐。再与蛋白质作用生成发光剂-蛋白质结合物。蛋白质分子能偶合重氮盐的位置有酪氨酸残基上酚羟基邻位，组氨酸残基的咪唑环、色氨酸残基的吲哚环等。
重氮化反应用于标记发光剂具有简便易行、成本低、重复性好等优点。但因反应是建立在NO2-与-NH2作用的原理上，若标记物结构中无伯氨基则不易选用此方法。同时因脂肪族伯氨基与NO2-的反应产物不稳定，易分解。所以，像ABEI、AHEI等伯氨基位于侧链的发光剂也不能选用此法进行直接标记。这使重氮化法的应用受到一定的限制。
3.混合酸酐法
结构中含有羧基的分子（标记物或被标记物）在三乙胺或正三丁胺等的存在下与氯甲酸酯类反应，生成活泼的混合酸酐中间体。混合酸酐能与另一分子的氨基反应形成酰胺键连接的共价化合物。目前采用的氯甲酸甲酯类有氯甲酸乙酯、氯甲酸异丁酯等。
4.N-羟基琥珀酰亚胺活化法
一些结构中含有羧基的抗原，经过N-羟基琥珀酰亚胺活化后再与发光剂的氨基偶联成酰胺键。含有羧基的发光剂和催化剂（如血红素类）也可以经过活化用来与抗原的氨基偶联。
5.过碘酸盐氧化结合法
此方法也称为“过碘酸钠法”。先是利用过碘酸盐氧化糖蛋白中糖基的邻二羟基成为醛基，然后醛基与伯氨基反应形成Schiff碱。Schiff碱经NaBH4还原-N=C-键成为稳定的结合物。
过碘酸钠法也可用于酶免疫测定中制备酶标结合物。醛氨缩合成的Schiff碱经NaBH4还原后的单键稳定性好，标记物不易脱落。凡含有芳香伯胺或脂肪伯胺的标记物都可以选用此法。但因过碘酸钠法的氧化反应需有邻二羟基存在，所以不适用于无糖基的蛋白质。对于某些虽含有糖基，但氧化糖基后会影响免疫学性质的物质，也不易选用过碘酸钠法进行标记。
6.环内酸酐法
通常用琥珀酸酐作为连接的“桥”，所以又称为“琥珀酸酐法”。利用环内酸酐与分子中的羟基或氨基反应形成半酯或半酰胺。在经过碳二亚胺法或混合酸酐法使其与另一分子中的氨基作用形成酰胺键。标记物与被标记物通过一个琥珀酰基连接到一起。该方法的优点是避免使用其他双功能交联剂时存在的副反应。保证标记物和蛋白质分子间的单向定量缩合，得到的结合物具有较高的标记率。
7.硫氰酸酯衍生物法
利用CSCI2先与标记物（或被标记物）的-NH2反应形成硫氰酸酯衍生物，再与被标记物（标记物）偶联成结合物。偶联的位置主要是赖氨酸残基的游离氨基上。标记反应的条件温和，获得的结合物性质稳定，而且不损失活性。
8.O-（羧甲基）羟胺法
抗原结构中的羰基（或经过反应形成的羰基）与O-（羧甲基）羟胺作用能缩合成O-羧甲基衍生物。O-羧甲基衍生物利用结构中的羧基与标记物中的氨基结合成结合物。
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9.戊二醛法
戊二醛作为一个双功能偶联试剂可通过其两个醛基分别与标记物及被标记物的伯氨基缩合，通过一个五碳桥偶联成结合物。由于戊二醛在溶液中不仅以单体形式存在，而且出现大量的聚合体，故能在参与标记的双方分子间构成较大的距离，有利于减少在抗原抗体反应时的空间阻碍。因此该方法作为标记酶的手段曾得到较多的研究。由于戊二醛法的偶联不易定量控制并缺乏特异性，易引起同类物质的自身聚合，所以在发光免疫测定标记中未受到广泛重视。
影响标记的因素
1.发光剂的选择：
发光免疫测定法应根据实际需要和客观条件的限制来选择发光剂。由发光剂的结构性质选择相应的标记方法。在使用环酰肼类发光剂作为标记物时，应优先选用异鲁米诺及其衍生物，尤其是带有侧链的衍生物（ABEI、AHEI等）。这不仅是由于参加偶合反应的氨基位于支链端而减弱了偶合时空间位阻效应，使之更易与蛋白质等大分子连接。氨基的烷基化作用可增加芳环的量子效应，减少发光效率的损失。吖啶酯类发光剂多选用N-羟基琥珀酰亚胺活化法进行标记。此类发光剂具有比鲁米诺大的发光效率，在比较温和的条件下仅有过氧化氢和稀碱便可激发化学发光。
2.被标记蛋白的性质：
抗原作为被标记物时，应具有较高的纯度和免疫学稳定性。抗体作为被标对象则要求具有较高效价。同时需要提纯IgG以代替全血清制备结合物，以减少血清中所含有的某些氧化酶类妨碍结合物的稳定性，也可以排除某些发光物质干扰发光免疫测定。
3.标记方法的选择：
标记方法之间差异较大，不同方法都有独特的反应条件和适应对象。熟悉这些方法的原理和应用情况正确选择与发光剂和被标记物结构特点相适应的偶联方式是顺利开展发光免疫测定法的必要条件。
4.原料比：
在制备发光剂-IgG结合物时，IgG：发光剂和交联剂：IgG的分子浓度比（原料比）能影响结合物的发光效率。当确定一种交联剂后，必须仔细地选择它们之间的分子浓度比。选出最佳反应的交联剂：IgG：发光剂的反应浓度。
5.标记率：
指结合物结构中IgG结合发光剂的分子比。由于对应于每一种发光剂或被标记物制备的结合物都有特定的最佳标记率。标记率选择不好会造成发光效率低、不易保存和使用等现象。为确保结合物的发光效率和稳定性，应用中应当根据发光剂和被标记物的性质，通过实际实验选择出适用的标记率。
6.温度：
对于比较稳定的小分子来说被标记物的温度控制不必太严。而当被标记物是抗原或抗体蛋白质时，由于蛋白质对热的不稳定性，应当在保证反应进行前提下尽量选择低温条件，以免在标记过程中造成蛋白质分解、变性和丧失活性。
7.纯化与保存：
多数经偶合反应制备的结合物使用前都需进行纯化。其主要目的是除去反应系统中存在的未结合发光剂和交联剂。一般可利用透析法、凝胶过滤法和盐析沉淀法等进行纯化。提纯的结合物应及时测定蛋白质的含量、免疫学活性和发光效率等指标。由于标记过程的不规范或存放过程中可能出现的脱落现象，对于新制备的或经较长时间保存的结合物在使用前都要测定这三项指标，以保证实验结果准确、可靠。结合物一般可分装保存在4-70℃条件下。最好能经过冰冻干燥保存，这可保存数年之久不丧失活性。
参考文献
[1]韩刚毅. 发光免疫测定法的标记技术[J]. 生物化学与生物物理进展, 1987, 75(03): 28-32.
[2]林金明, 赵丽霞, 王栩. 化学发光免疫分析[M]. 北京: 化学工业出版社, 2008, 50-52.
[3]Gadow A, Fricke H, Strasburger C J , et al. Synthesis and Evaluation of Luminescent Tracers and Hapten-Protein Conjugates for Use in Luminescence Immunoassays with Immobilised Antibodies and Antigens. A critical study of macro solid phases for use in immunoassay Systems, Part II[J]. CCLM, 1984.
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