猴痘病毒(MPXV)的检测方法
猴痘病毒(Monkeypox virus, MPXV)与天花、牛痘属于正痘病毒属(Orthopoxvirus genus)。1970年9月1日,在刚果民主共和国(当时称为刚果共和国)的巴桑库苏医院首次发现了人类MPXV病例。猴痘病毒主要由啮齿、灵长类等野生动物传播给人,并在人际间有限的传播,引起一种罕见的病毒性人畜共患病——猴痘。猴痘临床症状与天花相似,但症状较轻。猴痘早前主要发生在中非和西非靠近热带雨林的偏远地区,随着对人类的适应MPXV逐渐演化为:中非(刚果盆地)和西非两个进化枝,其中刚果盆地分支毒性和传播能力更强。
猴痘病毒介绍
猴痘病毒是一种有包膜的双链DNA病毒,对宿主细胞DNA和RNA复制的依赖程度很低,可在宿主细胞质中复制。与同属病毒相似,MPXV很可能在宿主细胞质中复制形态独特的胞内成熟病毒(IMV)和胞外包膜病毒(EEV)。IMV具有坚固的物理结构,便于在宿主之间传播,而更脆弱的EEV被包膜包裹,限制宿主免疫清除,因此适合病毒在细胞间传播。MPXV能有效地感染人原代单核细胞,通过抑制CD4+和CD8+ T细胞活化,消除局部T细胞反应,避免全身免疫抑制及免疫监测。
猴痘病毒临床诊断
猴痘的最佳诊断样本来自皮肤病变——囊泡和脓疱液体,以及干燥的结痂。病变样本必须储存在干燥、无菌的试管中(无病毒运输介质)并保持低温。猴痘的临床诊断必须考虑其他皮疹疾病如:水痘、麻疹、细菌性皮肤感染、疥疮、梅毒和药物相关过敏。发病前期的淋巴结病可能是区分猴痘与水痘或天花的唯一临床特征。
1.1 电镜活检
电镜下MPXV呈胞浆内砖状,有侧体,中心核约200-300 nm。由于OPV物种在形态上无法区分,该方法不能确定诊断,但可以提示该病毒属于痘病毒科。
1.2 基因检测
1.2.1 实时荧光定量PCR
对临床、MPXV感染细胞培养物的MPXV DNA进行常规检测,使用PCR或real-time PCR,建议在生物安全三级设施中进行。采用real-time PCR方法针对细胞外包膜蛋白基因(B6R)、DNA聚合酶基因、E9L的保守区,DNA依赖RNA聚合酶亚基18、rpo18和F3L基因进行检测。
1.2.2 限制性内切酶片段长度多态性(RFLP)
PCR扩增基因或基因片段的限制性长度片段多态性(Restriction length fragment polymorphism, RFLP)也可用于MPXV DNA的检测,但RFLP费时且需要病毒培养。PCR产物的RFLP也需要酶切后进行凝胶电泳,在快速、敏感和特异性至关重要的临床环境中可能不是最佳的方法。
1.2.3 高通量测序技术(NGS)
采用NGS技术的全基因组测序仍然是区分MPXV和其他正痘病毒(OPV)表征的金标准,但该技术成本较高,测序数据的下游处理需要巨大的计算能力。因此,在撒哈拉以南非洲资源贫乏的国家NGS可能不是合适方法。
基因检测技术中real-time PCR仍是MPXV常规诊断的首选方法,但必须辅以现场基因组测序技术,如Oxford Nanopore MinION,才能提供实时的病毒基因组数据,这对于循证流行病学干预是必不可少。
1.3 免疫检测方法
猴痘病毒免疫检测方法主要包括酶联免疫吸附试验(ELISA)检测IgG、IgM抗体和免疫组化检测病毒抗原。用MPXV抗体进行免疫化学分析,可区分痘病毒感染和疱疹病毒。
已经证实,抗病毒抗体和T细胞反应在疾病发作前后增加,在皮疹发生后5天左右和8天以上的血清中分别检测到猴痘病毒IgM和IgG。如果有皮疹和严重疾病史的未接种疫苗的个体血清中存在IgM和IgG抗体,则诊断可能存在MPXV感染。IgM捕获ELISA阳性表明最近接触过MPXV,而IgG捕获ELISA阳性表明该个体以前通过接种疫苗或自然感染接触过MPXV。在一个样本中同时存在IgM和IgG,表明在以前接种过疫苗或接触过自然感染MPXV的个体。然而,正痘病毒具有血清学交叉反应性,抗原和抗体检测方法不能提供猴痘特异性确认,但对于MPXV流行地区的血清学检测也许是可行的方法。
参考文献
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