从基因&蛋白组学水平分析猴痘ⅠB进化支对MPXV检测的影响
2022年，猴痘病毒（MPXV）Ⅱ进化支在全球爆发，传播到111个以上此前未报告病例的国家，主要影响欧洲和美洲的男同性恋群体。在接下来的一年里，非洲的MPOXⅠ进化支病例数量激增，截至2024年6月，刚果民主共和国26个省中的25个省报告了2万多例病例和1000例死亡。最近发现，部分原因是由于2023年9月始于南基伍省卡米图加（Kamituga）市另一种猴痘暴发。由高度分化的MPXVⅠ进化支引起，现在被指定为Ⅰb进化支。
1.Ⅰb进化支与其他进化支有何不同
1.1 传播方式
猴痘进化分支直接决定了的传播途径及感染相关的症状。MPXVⅠ和Ⅱa进化支很少在人与人之间传播，主要由啮齿动物和小型哺乳动物通过人畜共患传播，而Ⅱb进化支则通过与受感染个体的性接触和非性接触在人与人之间有效传播。在提出的Kamituga Ⅰ进化支暴发之前，很少有MPXVⅠ进化支人际传播病例的记录；而在Kamituga市发现的Ⅰb进化支主要通过与感染个体的异性性接触传播，且观察到广泛年龄范围（包括儿童）的社区传播。Ⅰb进化支人与人之间的传播方式，可能更容易造成社区层面的传播。
1.2 基因序列
为了鉴定Kamituga暴发期间MPXV基因组的突变，以全基因组方式对参考基因组（NC_003310.1）进行了定位。猴痘病毒Ⅰb进化支RNA全基因组测序结果显示，Kamituga序列与其他Ⅰ进化支成员的分离可能是由于大量的移码突变、插入和缺失。研究人员获得的6个Ⅰb进化支样本平均存在201.5个SNP、28个插入、81个缺失（deletion）、2个缺失（indel）、311.5个总突变、158.3个氨基酸替换、81.66个基因间突变、72.16个同义突变、106个错义突变、41.16个移码突变和3.33个框内缺失。通过在蛋白质组水平上对Kamituga MPXV序列进行突变定位，观察到在这些突变中，包括C9L（OPG047）、I4L（OPG080）、L6R（OPG105）、A17L（OPG143）、A25R（OPG151）、A28L（OPG153）和B21R（OPG210）在内的7个蛋白为突变热点，出现了许多一致的框内缺失、移码突变、同义突变和氨基酸替换。在6个样本中还发现了D14L（OPG032）基因共同缺失，以及在参考基因组中不存的14个独特基因D2L、D4L、D17L、D18L、C3L、A26L、A27L、A48R、B15L、B1R、B18R、K1R、R1R和N2R[1]。
图1. Kamituga MPXV ⅠB进化支突变图谱
注：基于参考MPXVⅠ进化支基因组（ID:NC_003310）的结构示意图基因名称和位置，根据正痘病毒基因命名法（如OPG001）和更新的MPXV RefSeq（J1L）注释绘制。基因的取向反映在箭头上。红色、蓝色和粉红色字分别表示错义、同义和蛋白质改变的突变名称。红色圆圈表示框内缺失突变，蓝色矩形表示移码突变。每个顶部有一个圆圈的黑线表示EBI定义的新功能/稀有功能。基因根据其生物学功能用颜色区分。绿色：参与免疫调节，橙色：转录，紫色：病毒复制/修复，黄色：细胞进入/附着，粉色：形态发生；深蓝色：毒力；浅蓝色：细胞间融合，黑色：假设的基因，浅黄色：未知的基因。被删除的Ⅰ进化支特异性OPG032基因用红色箭头表示。
1.3 突变热点蛋白
1.3.1 C9L（OPG047）
猴痘中的C9L基因编码一种Kelch样蛋白，该蛋白作为先天免疫反应的拮抗剂发挥重要作用。C9L是MPXV基因组中唯一的Kelch样蛋白，而其他正痘病毒含有多种Kelch样蛋白。C9L基因在正痘病毒中高度保守。在VACV中，C9L在感染早期表达，并作为Ⅰ型干扰素反应拮抗剂，编码一种锚蛋白重复蛋白/F-box蛋白，该蛋白在感染VACV的人细胞中显示干扰抗病毒活性。MPXV C9L基因含有RNA Gquadraplex（RG4），该基因在基因组进化后易发生结构变化（不稳定性）。在MPXV中，就像VACV一样，C9L蛋白被认为可以抑制宿主的先天免疫反应，但还需要进一步研究确认。有人提出，在2022年全球爆发期间测序的猴痘基因组包含最不稳定的RG4结构（即C9L-RG4-5），C9L的变异性可能驱动病毒的传播。在MPXVⅠB进化支中C9L具有一个框内缺失（DGMG483-486E）和一个移码突变（D483X），具有三个一致的氨基酸替换（L151H，V127E和Y114N）。与V亚群（JX878417）相比，发现该蛋白具有独特的框内缺失。
1.3.2 I4L（OPG080）
I4L是一个编码核糖核苷酸还原酶（RR）大亚基蛋白的基因，该蛋白可能参与核苷酸的合成。该基因在非分裂细胞中的病毒复制中起作用。RR是高度保守的酶，在三磷酸脱氧核苷（dNTP）合成过程中催化限速步骤；在正痘病毒（包括VACV和MPXV）中，RR编码R1和R2亚基，可作为抗病毒靶点。在MPXVⅠB进化支中I4L有两个一致的同义突变（T372和T31），三个氨基酸替换（A685P，R358G和G260S）。
1.3.3 L6R（OPG105）
L6R（OPG105）基因编码RNA聚合酶亚基（RPO147），在猴痘中的作用很少被描述；该基因可能在病毒基因组的转录中起作用。分析显示在MPXVⅠB进化支中，该蛋白含有一个共性移码突变（P285X），一个同义突变（A396）和三个氨基酸替换（V431A，R475C和D506Y）。
1.3.4 A25R（OPG151）
A25R基因编码RPO132亚基，预计该亚基是病毒RNA聚合酶复合物的一个组成部分，对病毒将其DNA复制成RNA的能力至关重要。尽管A25R对MPXV致病性的具体贡献尚未完全了解，但其在各种MPXV中的高度保守性强调了其在病毒生命周期中的关键作用。A25R基因位于病毒基因组的核心区中心，与其他正痘病毒的序列同源性超过90%，这进一步凸显了其作为药物靶点的重要性和潜力。需要进一步的研究来阐明A25R对毒力和宿主相互作用的确切贡献。
1.3.5 A17L（OPG143）
A17L是宿主细胞进入和融合所必需的病毒包膜蛋白。在VACV中，A17L在病毒粒子组装中起着重要作用，并有助于确定蛋白质相互作用、裂解、磷酸化和二硫键形成的细胞内位点。A17L被F10激酶磷酸化，是感染后期表达的VACV的主要跨膜组分。尽管该基因尚未在MPXV中明确描述，考虑到它在研究样本中高度保守，它可能增强了病毒的进入和感染。在MPXVⅠB进化支中，该蛋白包含两个一致的同义突变（E110和R127）和三个氨基酸替换（A289T，V304A，V322A）。
1.3.6 C7L（OPG045）
C7L基因在MPXV中的作用类似于F1L基因在VACV中的作用。在VACV中，F1L作为细胞凋亡抑制剂，通过与促凋亡的Bcl-2家族蛋白Bak和Bax结合，帮助病毒逃避宿主的先天免疫防御。这些蛋白是线粒体膜完整性和细胞色素C释放的关键调节因子。F1L还能抑制caspase-9和NLRP1炎性体，从而增强病毒在宿主体内的复制和存活。虽然直接研究C7L在MPXV中作用的具体研究并不普遍，但考虑到正痘病毒家族成员之间的遗传和功能相似性，推断C7L可能在MPXV中发挥类似的作用。该基因可能会抑制免疫反应，增强病毒在宿主内的存活和传播。
1.3.7 A28L（OPG153）
A28L编码P4c前体蛋白，参与宿主的细胞进入和退出过程。该基因显示出很高的保留率，这表明它在病毒的生命周期中起着至关重要的作用，并有可能成为疫苗开发的目标。在最近的一项研究中，从A28L蛋白中鉴定了大量的表位，并提出了多表位候选疫苗，表明其免疫原性潜力。对这些表位的分析表明，它们可以引起体液和细胞免疫反应，是一种潜在的MPXV免疫原性结构设计补充方案。在ⅠB进化支的A28L中观察到7个残基移码缺失（DDDDDII367-373-）、移码突变（D384X、D386X和DD386-387X）和两个氨基酸取代。
1.4 早前的研究热点蛋白
A29L、A35R、B6R、M1R等是早前猴痘研究中比较热点的位置。在MPXVⅠB进化支中，A29L（OPG154）、A35R（OPG161）这两个蛋白的基因未发生突变，而B6R（OPG190）和M1R（OPG095）上发生了同义突变。
2.高度分化对分子检测的影响
MPXVⅠ进化支和Ⅱ进化支之间的序列相似度> 99%，与其他正痘病毒相似度> 90%，这为进化支特异性靶序列的开发带来了极大的挑战。美国疾病控制和预防中心（CDC）针对不同的进化支推荐了相应的引物：MPXV通用（G2R_G）、Ⅰ进化支（C3L）和Ⅱ进化支（G2R_WA）。新报道的MPXVⅠb进化支的基因组分析显示，Ⅰ进化支MPXV的靶序列（在C3L基因内）缺失，这种缺失将影响MPXV进化支检测的准确性（取决于所使用的检测方法），导致新型Ⅰb进化支菌株的假阴性结果，这可能影响对Ⅰb进化支病毒的传播监测和防控，特别是在目前流行的MPXVⅡb进化支（温和病毒）存在的情况下[2]。
Ⅰb进化支的PCR检测方法
鉴于MPXVⅠb进化支靶序列（在C3L基因内）缺失，最近有研究人员开发了一种新的实时PCR检测（dD14-16）专门用于检测MPXVⅠb进化支，并且可以与其他基于Taqman的检测方法一起用于MPXV检测区分。但由于实验的MPXV DNA剩余不足，未进行重复实验，该方法有效性还有待进一步证实。
图2. MPXV特异性引物扩增结果
注：dD14-16检测采用具有一个5'-报告分子（FAM）和一个3'-猝灭分子（BHQ1）的探针，即5'-FAM-ATATTCAGGCGCATATCCACCCACGT-BHQ-3'，正向引物5'-AAGACTTCCAAACTTAATCACTCCT-3'，反向引物5'-CGTTTGATATAGGATGTGGACAT TT-3'。MPXV_CladeIb_1L/2L/3L/4L/7O/9L是Masirika等人首次描述的Ⅰb进化支序列。图A中MPXV通用引物和探针在Ⅱa进化支和Ⅱb进化支中存在正向和反向引物不匹配（彩色）。图B中Ⅰ进化支的CDC引物和探针在Ⅰb进化支中缺失，仅在Ⅰ进化支中存在。图C中新的正向和反向引物和探针，跨越Ⅰb进化支序列缺失的上下区域。与先前描述的Ⅰ分支序列（如序号7（MPXV_Clade1_DQ011155））相比，缺失1140 bp。
参考文献
[1]Masirika LM, Kumar A, Dutt M, et al. Complete Genome Sequencing, Annotation, and Mutational Profiling of the Novel Clade I Human Mpox Virus, Kamituga Strain. J Infect Dev Ctries[J]. 2024,18(4):600-608.
[2]Schuele L, Masirika LM, Udahemuka JC,et al. Real-time PCR assay to detect the novel Clade Ib monkeypox virus, September 2023 to May 2024. Euro Surveill[J].2024,29(32):2400486.
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