WS/T 677-2020人群维生素D缺乏筛查方法

中华人民共和国国家卫生健康委员会发布
2020-05-06 发布，2020-11-01实施

本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。

本标准起草单位：中国疾病预防控制中心营养与健康所、宁波市疾病预防控制中心、深圳市慢性病防治中心、深圳市计量质量检测研究院、南京医科大学、中粮营养健康研究院。

本标准主要起草人：杨丽琛、杨晓光、胡贻椿、金米聪、杨国武、周继昌、汪之顼、贾健斌、王俊、陈晓红、张协光、莫俊銮、毛德倩、付志成、王睿、丁叶、周明、陈竞、张森。

1 范围

本标准规定了人群维生素D缺乏和不足筛查的指标、参考判定值和检测方法。

本标准适用于人群维生素D营养状况的判定。

2 规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 603 化学试剂 试验方法中所用制剂及制品的制备
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
WS/T 225 临床化学检验血液标本的收集与处理

3 术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1 25-羟基维生素D 25-hydroxyvitamin D；25(OH)D

血液中维生素D的主要循环形式，稳定性好，是公认的评价人体维生素D营养状况的可靠指标，主要包括两种形式：25(OH)D₂、25(OH)D₃，其中25(OH)D₃是血液中维生素D的主要存在形式。

3.2 维生素D缺乏 vitamin D deficiency

当人体血清（或血浆）25-羟基维生素D含量低于缺乏的参考判定值时，可判定为维生素D缺乏。

3.3 维生素 D不足 vitamin D insufficiency

当人体血清（或血浆）25-羟基维生素D含量低于正常人群的参考判定值，但高于缺乏参考判定值时，可判定为维生素D不足。

4 人群维生素D营养状况判定指标及参考判定值

人群维生素D营养状况判定指标及参考判定值见表1。

5 测定方法

5.1 血液标本的采集与保存

按附录A规定的方法进行。

5.2 第一法：液相色谱串联质谱法

按附录B规定的方法进行。

5.3 第二法：化学发光免疫法

按附录C规定的方法进行。

5.4 第三法：酶联免疫法

按附录D规定的方法进行。

附录A

血液标本的采集与保存

A.1 标本采集

A.1.1 血液标本的采集

空腹静脉血，取血方法依据WS/T 225 以及检测方法的要求采集空腹静脉血1mL。

A.1.2 采血管

根据所需血清或血浆，使用不同采血管分装。

A.2 血清、血浆保

标本于2℃～8℃可稳定7d，-20℃可稳定12个月。若标本不能及时检测，建议适量分装后于-70℃以下存放标本，仅一次冻融。

附录B

液相色谱串联质谱法

B.1 原理

血清（血浆）中的25(OH)D2和25(OH)D3经甲醇/乙腈沉淀蛋白，采用正己烷萃取，氮气吹干，用初始流动相复溶，使用液相色谱法分离，串联质谱多反应监测模式（MRM）检测，同位素内标法定量，该方法可以分别测定25(OH)D₂和25(OH)D₃。

B.2 试剂和溶液

除非另有说明，本方法所有试剂均为分析纯，水符合GB/T 6682中一级用水规定，溶液按照GB/T 603配制。

B.2.1 试剂

B.2.1.1 25(OH)D?₂标准品（C₂₈H₄₄O₂，CAS：21343-40-8）：纯度＞98%或有证标准物质。

B.2.1.2 25(OH)D3标准品（C₂₇H_{44O2，CAS：19356-17-3）：纯度＞98%或有证标准物质。}

B.2.1.3 同位素内标[²H₃]-25(OH)D₂标准品（C₂₈H₄₁²H₃O₂，CAS：1217467-39-4）：纯度＞98%。

B.2.1.4 同位素内标[²H₃]-25(OH)D₃标准品（C₂₇H₄₁²H₃O₂，CAS：140710-94-7）：纯度＞98%。

B.2.1.5 甲醇（CH₃OH）：色谱纯。

B.2.1.6 正己烷（C₆H₁₄）：色谱纯。

B.2.1.7 甲酸（HCOOH）：色谱纯。

B.2.1.8 牛血清白蛋白（BSA）：纯度≥98%。

B.2.1.9 氮气（N2）：纯度≥99.9%。

B.2.1.10 甲酸-水溶液：0.1%。

B.2.1.11 甲酸-甲醇溶液：0.1%。

B.2.1.12 乙腈（CH₃CN）：色谱纯。

B.2.1.13 BSA牛血清白蛋白水溶液：1%。

B.2.1.14 沉淀剂：甲醇+乙腈（1+1）。

B.2.1.15 标准储备溶液（10μg/mL）：分别称取25(OH)D₂和25(OH)D₃标准品1mg（精确至0.01mg）于2个100mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度。此溶液中25(OH)D₂和25(OH)D₃ 的浓度为10μg/mL。溶液转移至试剂瓶中后，-20℃下避光保存，备用。

B.2.1.16 同位素内标标准储备溶液（10μg/mL）：分别称取同位素内标[²H₃]-25(OH)D₂和[²H₃]-25(OH)D₃ 1mg（精确至0.01mg），于2个100mL容量瓶中，用甲醇溶解，并定容至刻度。此溶液中[²H₃]-25(OH)D₂和[²H₃]-25(OH)D₃的浓度为10μg/mL。溶液转移至试剂瓶中，-20℃下避光保存，备用。

B.2.1.17 标准系列溶液：分别准确移取25(OH)D₂（10μg/mL）和25(OH)D₃（10μg/mL）5μL、10μL、25μL、50μL、125μL、250μL和500μL于7个10mL容量瓶中，用甲醇稀释并定容至刻度。此系列溶液的25(OH)D₂和25(OH)D₃的浓度为5ng/mL、10ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、125ng/mL、250ng/mL和500ng/mL。

B.2.1.18 混合同位素内标溶液（100ng/mL）：分别准确吸取同位素内标[²H₃]-25(OH)D₂储备溶液（10μg/mL）和[²H₃]-25(OH)D₃储备溶液（10μg/mL）各100μL，于10mL容量瓶中，用甲醇稀释并定容至刻度。此溶液的同位素内标[²H₃]-25(OH)D₂和[²H₃]-25(OH)D₃的浓度均为100ng/mL。溶液转移至试剂瓶中后，-20℃下避光保存，备用。

B.2.2 仪器和设备

B.2.2.1 分析天平，感量：0.0001g。

B.2.2.2 分析天平，感量：0.00001g。

B.2.2.3 液相色谱-串联质谱联用仪。

B.2.2.4 氮吹仪或真空离心干燥仪。

B.2.2.5 离心机：离心力≥12000×g。

B.2.2.6 旋涡混合器。

B.2.2.7 移液枪或移液器。

B.3 分析步骤

B.3.1 样品制备

取血清（血浆）样品200μL至2mL离心管中，加入20μL混合同位素内标溶液，涡旋振荡30s。加入400μL沉淀剂（甲醇+乙腈，1+1），室温下涡旋振荡混匀30s；加入1.2mL正己烷，室温下涡旋振荡5min，然后在4℃和离心力大于12000×g下离心5min；吸取1.0mL上清液至1.5mL离心管中，室温下用氮气吹至干；用100μL初始流动相复溶，涡旋振荡30s，4℃和离心力大于12000×g下离心5min，上清液转移至进样瓶中待LC-MS/MS分析。

B.3.2 标准工作溶液制备

取7个2mL离心管，分别加入180μL空白替代血清样品（1%BSA牛血清白蛋白水溶液），以及20μL标准系列溶液（B.2.1）和20μL混合同位素内标溶液，此系列相当于0.5ng/mL～50ng/mL浓度范围。旋涡振荡30s。以下操作同B.3.1。

B.3.3 液相色谱-串联质谱联用仪参数设置

B.3.3.1 液相色谱分析参考条件：

a) 色谱柱：C₁₈柱（柱长100mm，柱内径2.1mm，填料粒径1.7μm，或者具同等柱效的色谱柱)；
b) 流动相：A相：含0.1%甲酸的水溶液；B相：含0.1%甲酸的甲醇溶液；
c) 梯度洗脱：见表B.1；
d) 流速：0.30mL/min；
e) 柱温：40℃；
f) 进样体积：10μL。

B.3.3.2 质谱测定参考条件：

a) 电离方式：电喷雾电离，正离子模式（ESI⁺ ）；
b) 检测方式：多反应监测模式（MRM）；
c) 气帘气：0.25MPa；
d) 喷雾电压：4000V；
e) 去溶剂气温度：450℃；
f) 雾化气：0.35MPa；
g) 去溶剂气：0.35MPa；
h) MRM离子对参数见表B.2所示。

B.3.4 定性测定

在同一色/质谱条件下进行标准溶液和样品溶液的测定，如果样品溶液中检出的色谱峰的保留时间与标准溶液中检出的色谱峰的保留时间一致，所选择的离子对的质荷比也一致，而且样品溶液中定性离子对的相对丰度与浓度相当的标准溶液中的定性离子对的相对丰度比较，相对偏差也不超过表B.3规定的范围，则可判定样品溶液中存在该物质。

B.3.5 工作曲线的制作

在B.3.3的液相色谱和串联质谱分析条件下，将B.3.2得到的标准工作溶液由低浓度到高浓度进行进样分析，以25(OH)D₂和25(OH)D₃色谱峰，与其对应的同位素内标色谱峰的峰面积比值-浓度进行线性回归，得到标准工作溶液的直线拟合方程，其线性相关系数应大于0.99。

B.3.6 样品测定

在B.3.3的液相色谱和串联质谱分析参考条件下，将B.3.1得到的待测样品溶液进样分析，按内标法计算待测试样溶液中目标物的质量浓度。待测试样溶液中的目标物的质量浓度应在标准工作曲线的线性范围内，超过线性范围则应适当稀释样品后再重复处理测定。

B.3.7 空白试验

以1%BSA牛血清白蛋白水溶液代替血清（血浆）样品，按B.3.1的步骤做空白试验。

B.4 质量控制

B.4.1 内部质控

实验室应制定测试结果质量控制程序，明确内部质量控制的内容、方式和要求。随同样品检测需测定质量控制样品，绘制质量控制图，观察测试工作的稳定性、系统偏差及趋势，及时发现异常现象并采取相应的改进措施。

B.4.2 外部质控

实验室应参加国内外实验室认可机构组织的能力验证活动，参加国际间、国内同行间的实验室比对试验。根据外部评审、能力验证、考核、比对等结果评估检验结果的质量并采取相应的改进措施。

B.5 分析结果的计算

血清（血浆）样品中25(OH)D2和25(OH)D3 的质量浓度按式（B.1）计算：

C_target=c......................................(B.1)

式中：
C_target——血清（血浆）样品中目标物的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；
c——工作曲线中查出的样品浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；

注：结果用平行测定的算术平均值表示，保留小数点后一位，血浆(血清)中25(OH)D总含量为25(OH)D₂和25(OH)D₃含量相加。

B.6 精密度

在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。

B.7 检出限和定量限

本方法25(OH)D₂、25(OH)D₃检出限均为0.15ng/mL，定量限均为0.5ng/mL。

B.8 回收率

本方法的添加回收率为84.0%～106.0%。

B.9 25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3标准溶液LC-MS/MS色谱图

25(OH)D₂和25(OH)D₃标准溶液的LC-MS/MS色谱图见图B.1，[²H₃]-25(OH)D₂和[²H₃]-25(OH)D₃标准溶液的LC-MS/MS色谱图见图B.2。

说明：图B.1和图B.2中峰1为[²H₃]-25(OH)D_3>；峰2为[²H₃]-25(OH)D₂。

详细内容见PDF