联系我们

影响抗原/抗体诊断原料在胶体金平台应用的因素

对于产业化应用的抗原、抗体诊断原料,大多都可以满足胶体金检测平台的要求,但是由于体外诊断(IVD)试剂原料产品质量参差不齐,很多IVD原料供应商不会对自己的抗原/抗体诊断原料是否可以应用于胶体金平台而进行验证。相对来说,胶体金方法对抗原、抗体诊断原料的要求是比较高的,因为不管是胶体金标记还是NC膜包被都是基于物理吸附作用,这种结合过程是相对脆弱的,很容易受到干扰。

1. 纯化方法

镍柱纯化:重组抗原/抗体通常带有his等标签,通过镍柱纯化得到的抗原/抗体诊断原料含有大量的咪唑。微量的咪唑足可以使胶体金聚集、死金、沉淀,而且以包涵体形式表达的蛋白,往往需要高浓度的尿素来溶解,尿素对胶体金的破坏也是非常严重的。

硫酸铵沉淀或DEAE纯化:硫酸铵沉淀或DEAE纯化的血清含有大量的可竞争性结合胶体金颗粒表面结合位点的杂蛋白,产生的强电解质和高盐成分,从而影响检测分析的结果并降低检测分析的灵敏度。

ProteinA/G纯化:如果采用A蛋白或G蛋白柱层析纯化小鼠腹腔血清抗体作为胶体金结合物标记原料,由于抗体原料中含有大量的非特异性的小鼠本身IgG,导致胶体金结合物中含有大量非特异性的胶体金结合物,从而降低检测分析的灵敏度。而重组抗体则会避免小鼠自身的IgG,且纯度较高。

解决方法:如果抗原、抗体存在上述干扰物质,建议可以通过超滤或者透析去除。很多人反馈在透析重组抗原/抗体诊断原料的时候,很容易产生大量的沉淀,特别是包涵体抗原。主要原因是透析液不太合适,应选择尽量偏离蛋白等电点的pH缓冲液,如果不确定蛋白的等电点,建议用20mM Tris-HCL(8.5)或者20mM Tris-甘氨酸(8.5)来做透析液,适用于绝大部分的抗原抗体原料。

2. 亚型

单克隆抗体需要特别注意的是,不同的单抗类和亚型对胶体金标记的影响。一般来讲,IgG1亚型标记效果最好,其它亚型和类或多或少存在一定的局限性,但是我们经常会筛选到IgG2a、IgG2b这些亚型,甚至偶尔会遇到IgM、IgA,此时,这些最好用于NC膜的包被,绝大部分的亚型和类包被NC膜都没有问题。如果确实需要用于胶体金标记,建议有条件使用(如高标记pH,低标记量,强封闭)。

3. 纯度

在体外诊断试剂制备过程中,抗体标记效率与抗体的纯度有关。当抗体纯度较低时,会导致抗体与其他杂蛋白被一起标记,从而影响了试剂的反应性能,如特异性、反应信号、背景值等。抗体的纯度通常由细胞培养工艺和抗体纯化工艺所决定。使用无血清培养基可以很大程度上去除血清培养基中带来的杂质蛋白,而蛋白质纯化工艺则可以进一步将抗体中绝大多数杂质去除。

4. 保存液

在蛋白的保存过程中,可能会加入一些甘油、蔗糖之类的物质作为保护剂,而这些保护剂由于其强亲水性,对抗原/抗体诊断原料的胶体金标记和包被都会产生不利影响。

比较理想的抗原、抗体保存液:10mM/20mM PB(7.4~8.0)、10mM/20mM PBS(7.4~8.0)、20mM Tris-HCL(8.0~9.0)、20mM Tris-甘氨酸(8.0~9.0)。另外,可加入适量防腐剂,如:0.1%~0.5%叠氮钠,不推荐使用ProClin300防腐,ProClin300对胶体金标记会有一定程度的影响,虽然这种影响并不是很严重,但是有潜在的风险。

相关文章

 相关文章