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胶体金法检测平台

胶体金结构图

什么是胶体金?

胶体金(colloidal gold)是氯金酸(HAuCl4)在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下,金离子还原后聚合成的一定大小的金颗粒,它由一个基础的晶核(11个金原子形成的二十面体)和包围在外的双离子层构成(内层为负离子层AuCl2-,外层是带正电荷的H+)。由于静电作用,金颗粒之间相互排斥而悬浮成为一种稳定的胶体状态,形成带负电的疏水胶溶液,故称胶体金。胶体金具有高电子密度,能与多种生物大分子结合,已成为继荧光素、放射性同位素和酶之后,在免疫标记技术中较常用的一种非放射性示踪剂。胶体金的粒径一般在1-100nm之间,能够均匀、稳定地分散在液体中,呈球形小颗粒或椭圆形大颗粒。胶体金颗粒最外层可以吸附大量的正离子,能够均匀分散在溶液中。

由于胶体金表面呈负电性,能够与表面带正电荷的抗原、抗体通过静电作用进行标记。

胶体金法检测原理

胶体金试纸条结构图

将特异性的抗体以条带状固定在膜上(T线),胶体金标记试剂吸附在结合上(金垫),当待检抗原加到试纸条一端的样本垫上后,样本通过毛细作用向前移动,溶解结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应,再移动至固定的抗原或抗体的区域时,待检物与金标试剂的结合物又与之发生特异性结合而被截留,聚集在检测带上,可通过肉眼观察到显色结果。

胶体金技术优势与不足

优势

快速:所有反应能在15分钟内完成;

操作简便:便于个人自测或医院检测;

成本低:不需要特殊的仪器设备;

稳定性好:试剂效期可达两年或更长时间;

缺点

较ELISA、化学发光等方法灵敏度低;

易出现假阳性、假阴性;

存在HOOK效应;

胶体金试剂条组成

胶体金试纸条主要由样品垫、金垫、硝酸纤维素膜(NC膜)、吸水纸4个部分组成,从上至下依次首尾互相衔接,粘贴在PVC底板上。

作用

a. 样品垫:检测样本滴加位置,对检测样本具有一定的过滤和缓冲作用,降低样本中离子强度或酸碱度对检测结果的干扰。

b. 金垫:将胶体金标记抗体通过干燥固定在玻璃纤维素膜上,是追踪抗体与抗原的反应。

c. 硝酸纤维素膜:膜上预先包被上检测线和质控线,能够与胶体金标记物发生免疫反应相结合,使胶体金在检测线发生聚集,根据检测线的显色状况进行判读结果。

d. 吸水垫:通过吸水作用使液体样品向上流动,带动金垫的金标抗体向上移动,从而与检测线的抗原发生反应。

胶体金试纸条的制作过程

胶体金试纸条的制备过程

胶体金的制备

在溶液中金颗粒呈圆形,边缘平整,界限十分清楚。金颗粒表面带有大量负电荷,由于静电的排斥力,使其在水中保持稳定状态,形成胶体金。胶体金的制备方法有白磷还原法,抗坏血酸还原法,柠檬酸三钠还原法和鞣酸-柠檬酸三钠还原法。通过改变反应体系中氯金酸与还原剂的比例可得到所需不同直径的金颗粒。但前两种方法制备得到的金颗粒直径大小不均一,目前常用后两种方法。

柠檬酸三钠还原法胶体金的制备流程

以下流程供参考:

a. 取100ml超纯水倒入250ml锥形瓶中

b. 滴加1.0%氯金酸溶液1.0ml,置于磁力搅拌器中连续搅拌并加热至沸腾

c. 搅拌下快速加入1.0%柠檬酸三钠溶液1.8ml,此时溶液逐渐由浅黄色变成灰黑色最后变成橙红色

d. 待溶液变为橙红色后继续加热15min

e. 冷却至室温,0.1mol/ml K2CO3调节溶液pH至6.5左右

f. 超纯水定容至100ml后,置于棕色瓶中4℃保存备用

此时制备好的胶体金溶液应为澄清透亮,颜色均一,无异物,无漂金现象。

注意事项:

1)玻璃器皿的清洗

制金前,玻璃器皿先用王水或铬酸溶液浸泡24h,用自来水冲洗干净,然后依次用清洁剂洗涤3次,自来水冲洗3次,蒸馏水冲洗3次,双蒸水冲洗3次。

2)试剂的配制

必须使用双蒸水。氯金酸溶液可以放在4℃保存1年左右,还原剂柠檬酸三钠需要现配使用。

抗原/抗体诊断原料的胶体金标记

胶体金标记原理

在碱性条件下,胶体金颗粒表面带负电荷,可与抗原/抗体所带正电荷基团之间产生静电吸引而牢固结合,这种结合对所标记抗原/抗体的生物学活性无明显影响。环境pH和离子强度是影响胶体金与抗原/抗体吸附的主要原因,胶体金颗粒的大小、蛋白质的分子量及浓度等也影响蛋白质的吸附。

胶体金标记流程

胶体金标记流程图

注意事项

a. 胶体金最适pH的调整

用K2CO3或HCL溶液。原则啥办法可选择待标记抗原/抗体等电点,也可以略偏碱。但各标记物的最适反应pH往往需要多次试验才能确定。

b. 抗原/抗体最适标记量的确定

将待标记抗原/抗体作一系列稀释后,加入装有胶体金的试管中,然后分别加入NaCl溶液,混匀静置数小时,对照管与加入蛋白量不足的管颜色会由红变蓝,而蛋白量足或超过的管保持红色不变,其中含蛋白量最低的一管即为稳定胶体金所必须的最适标记量。

c. 标记过程

在电磁搅拌器下降1/10体积的合适浓度的抗原/抗体溶液加于胶体金溶液,反应一定时间后加入BSA并调整至pH8.0,放置至室温继续反应数分钟,封闭多余的游离胶体金,稳定胶体金标记物。

d. 离心去除未结合的抗原/抗体,各粒径的金粒子所需的离心转速与时间均不一样。

e. 离心后去上清,将沉淀用含PEG或BSA的缓冲液悬浮,恢复至原体积后再离心。

金标垫的制备

将标记好的金标复合物喷涂在玻璃纤维素上,在干燥间或烘箱中37℃将其烘干。

样品垫制备

将样品垫处理液浸涂在玻璃纤维素膜上,在干燥间或烘箱中37℃将其烘干。

印模制备

将硝酸纤维素膜(NC膜)贴在PVC底板上,将印模机的C、T线调整搭配合适的距离,然后进行印模,最后将印好的膜放在干燥间或烘箱中37℃将其烘干。

组板

将吸水垫和制备好的金垫、样品垫裁切至合适的宽度,与印好C、T线的硝酸纤维素膜贴在PVC板的位置。

切条

根据检测卡卡槽的宽度,将组装好的大板裁切成一定宽度的检测条,裁切宽度均一,无压痕,无划伤。

包装

将裁切好的检测条压入检测卡壳内。

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