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体外诊断(IVD)试剂分析方法--胶体金法检测平台

胶体金结构图

一、什么是胶体金?

胶体金(colloidal gold)是氯金酸(chloroauric acid)的水溶胶,具有高电子密度,能与多种生物大分子结合,已成为继荧光素、放射性同位素和酶之后,在免疫标记技术中较常用的一种非放射性示踪剂。胶体金的粒径一般在1-100nm之间,能够均匀、稳定地分散在液体中。其由一个基础金原子核与包围在外层的负离子层(AuCl2)构成,呈球形小颗粒或椭圆形大颗粒。胶体金颗粒最外层可以吸附大量的正离子,能够均匀分散在溶液中。

随着胶体金粒径的逐渐增大,胶体金溶液的颜色逐渐从橙色变成紫色。由于胶体金表面呈负电性,能够与表面带正电荷的抗原、抗体通过静电作用进行标记。

二、胶体金法检测原理

胶体金试纸条结构图

将特异性的抗原或抗体以条带状固定在膜上,胶体金标记试剂吸附在结合垫上,当待检样本加到试纸条一端的样本垫上后,通过毛细作用向前移动,溶解结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应,再移动至固定的抗原或抗体的区域时,待检物与金标试剂的结合物又与之发生特异性结合而被截留,聚集在检测带上,可通过肉眼观察到显色结果。

三、胶体金试纸条组成

胶体金试纸条结构

主要由样品垫、金垫、硝酸纤维素膜(NC膜)、吸水纸4个部分组成,从上至下依次首尾互相衔接,粘贴在PVC底板上。

作用

a. 样品垫:检测样本滴加位置,对检测样本具有一定的过滤和缓冲作用,降低样本中离子强度或酸碱度对检测结果的干扰。

b. 金垫:将胶体金标记抗体通过干燥固定在玻璃纤维素膜上,是追踪抗体与抗原的反应。

c. 硝酸纤维素膜:膜上预先包被上检测线和质控线,能够与胶体金标记物发生免疫反应相结合,使胶体金在检测线发生聚集,根据检测线的显色状况进行判读结果。

d. 吸水垫:通过吸水作用使液体样品向上流动,带动金垫的金标抗体向上移动,从而与检测线的抗原发生反应。

四、胶体金试纸条的组成

胶体金试纸条的制备过程

五、胶体金的制备

在溶液中金颗粒呈圆形,边缘平整,界限十分清楚。金颗粒表面带有大量负电荷,由于静电的排斥力,使其在水中保持稳定状态,形成胶体金。胶体金的制备方法有白磷还原法,抗坏血酸还原法,柠檬酸三钠还原法和鞣酸-柠檬酸三钠还原法。通过改变反应体系中氯金酸与还原剂的比例可得到所需不同直径的金颗粒。但前两种方法制备得到的金颗粒直径大小不均一,目前常用后两种方法。

胶体金的制备流程(柠檬酸三钠还原法)

以下流程供参考:

a. 取100ml超纯水倒入250ml锥形瓶中

b. 滴加1.0%氯金酸溶液1.0ml,置于磁力搅拌器中连续搅拌并加热至沸腾

c. 搅拌下快速加入1.0%柠檬酸三钠溶液1.8ml,此时溶液逐渐由浅黄色变成灰黑色最后变成橙红色

d. 待溶液变为橙红色后继续加热15min

e. 冷却至室温,0.1mol/ml K2CO3调节溶液pH至6.5左右

f. 超纯水定容至100ml后,置于棕色瓶中4℃保存备用

此时制备好的胶体金溶液应为澄清透亮,颜色均一,无异物,无漂金现象。

注意事项:

1)玻璃器皿的清洗

制金前,玻璃器皿先用王水或铬酸溶液浸泡24h,用自来水冲洗干净,然后依次用清洁剂洗涤3次,自来水冲洗3次,蒸馏水冲洗3次,双蒸水冲洗3次。

2)试剂的配制

必须使用双蒸水。氯金酸溶液可以放在4℃保存1年左右,还原剂柠檬酸三钠需要现配使用。

六、抗原/抗体诊断原料的胶体金标记

胶体金标记原理

在碱性条件下,胶体金颗粒表面带负电荷,可与抗原/抗体所带正电荷基团之间产生静电吸引而牢固结合,这种结合对所标记抗原/抗体的生物学活性无明显影响。环境pH和离子强度是影响胶体金与抗原/抗体吸附的主要原因,胶体金颗粒的大小、蛋白质的分子量及浓度等也影响蛋白质的吸附。

胶体金标记流程

胶体金标记流程图

注意事项

a. 胶体金最适pH的调整

用K2CO3或HCL溶液。原则啥办法可选择待标记抗原/抗体等电点,也可以略偏碱。但各标记物的最适反应pH往往需要多次试验才能确定。

b. 抗原/抗体最适标记量的确定

将待标记抗原/抗体作一系列稀释后,加入装有胶体金的试管中,然后分别加入NaCl溶液,混匀静置数小时,对照管与加入蛋白量不足的管颜色会由红变蓝,而蛋白量足或超过的管保持红色不变,其中含蛋白量最低的一管即为稳定胶体金所必须的最适标记量。

c. 标记过程

在电磁搅拌器下降1/10体积的合适浓度的抗原/抗体溶液加于胶体金溶液,反应一定时间后加入BSA并调整至pH8.0,放置至室温继续反应数分钟,封闭多余的游离胶体金,稳定胶体金标记物。

d. 离心去除未结合的抗原/抗体,各粒径的金粒子所需的离心转速与时间均不一样。

e. 离心后去上清,将沉淀用含PEG或BSA的缓冲液悬浮,恢复至原体积后再离心。

七、金标垫的制备

将标记好的金标复合物喷涂在玻璃纤维素上,在干燥间或烘箱中37℃将其烘干。

八、样品垫制备

将样品垫处理液浸涂在玻璃纤维素膜上,在干燥间或烘箱中37℃将其烘干。

九、印模制备

将硝酸纤维素膜(NC膜)贴在PVC底板上,将印模机的C、T线调整搭配合适的距离,然后进行印模,最后将印好的膜放在干燥间或烘箱中37℃将其烘干。

十、组板

将吸水垫和制备好的金垫、样品垫裁切至合适的宽度,与印好C、T线的硝酸纤维素膜贴在PVC板的位置。

十一、切条

根据检测卡卡槽的宽度,将组装好的大板裁切成一定宽度的检测条,裁切宽度均一,无压痕,无划伤。

十二、包装

将裁切好的检测条压入检测卡壳内。

十三、常见问题分析

(1)在检测中,C、T线颜色不一致,检测结果如何判断?

若是消线法,只要C,T线在规定时间内都显色,不管颜色是否一致,就可判为阴性,T线不显色则判为阳性。

若是比色法,T线比C线深,判为阴性,T线比C线浅或T线不显色,则判为阳性。

对于夹心法产品,只要C,T线在规定时间内都显色,就可判为阳性,T线显色越深,表示阳性越强。

(2)在使用检测卡过程中,能否用水或者其他液体作为阴性样本对照?

不能。一方面因为检测样本成分很复杂,用水作为阴性对照没有参考意义。另一方面不同的产品检测体系不同,用水作对照容易造成假阳或漏检等现象。

(3)不同厂家的检测卡作比较时,能做几份标本就下结论判断哪家产品好吗?

不能。判断试纸条主要的指标有灵敏度、特异性、稳定性、精密度等指标,其中灵敏度和特异性是最关键的。灵敏度的考评就需要由不同样本做添加,还需要由高浓度的阳性样本做倍比稀释。特异性也需要做不同区域和特殊样本的检验。因为不同厂家的检测条虽然原理是相同的,但原料来源不相同,做几份是不能反映检测条的综合性能指标。

(4)样品层析速度慢或者不发生层析

原因分析:

加样量太少

样本过于粘稠

试纸条失效

建议处理方案

增加加液量或滴加少量辅助液

滴加少量辅助液,对样本进行预处理以去除沉淀物

更换新试纸条重新检测,试纸条现拆现用

(5)测全血时,有大量的全血样本析出,NC膜背景偏红,影响结果判读

原因分析:

该试纸条NC膜严重受损或断裂

使用已溶血的全血标本

建议处理方案

更换新试纸条重新检测

尽量使用新鲜全血检测

(6)漏检率偏高

原因分析:

检测时间太短,判断结果过早

加样量太少,辅助液滴加过量,样本被稀释

样本中被检物浓度太低

个别样本中含有较为特殊物质,样本的pH值过高或过低

该试纸条受潮,活性下降或失活

建议处理方案

按说明书要求正确判读,建议对于较弱性或阴性样本可延迟

按说明书要求正确加样或辅助液

采用其他检测方法进行确认

(7)检测结果假阳性率高

原因分析:

该试纸条灵敏度偏高

该样本含有特殊干扰物或已被污染

在规定时间后判读结果

建议处理方案

提前判读结果或更换新检测卡重新检测

用其他检测方法确诊检测结果,确保样本不受污染

按说明书要求正确判读结果,超出判读结果的时间范围,结果不准确

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