抗体效价

我们常说的抗体效价（antibody titer）也能够被称为抗体滴度，是特异性抗体生物活性的重要标志，反应了特异性抗体与抗原的结合能力。抗体效价是疾病诊断、特异性免疫球蛋白制备和疫苗评价等领域的重要指标，对其检测在临床上意义重大。

从细胞化学角度说，抗体效价指的是抗体在保持其最佳特异性染色，并且具备最小背景染色条件下的最高稀释倍数（通俗一点讲就是抗体识别特定抗原决定部位所需要的最低浓度）。

抗体效价的表示

抗体效价通常用“1：X”的形式表示（X表示抗体可以被检测出来的最大稀释倍数），例如抗体效价为1:32,000，就表示抗体被稀释到32,000倍仍可以检测出来，再稀释就检测不出来了。“：”后面的数值越大，抗体效价越大，表示抗体与抗原结合能力越强。

抗体效价测定

抗体效价通常通过ELISA方法来检测，其实验原理为将血清样品先稀释一定倍数后，在酶标板中逐孔倍比稀释加样，采用常规ELISA方法检测，读取OD值。OD值高于空白对照2倍的孔判断为阳性，颜色最淡的一孔阳性孔的稀释倍数即为该血清样品中目的抗体效价比。

目前常用的几种ELISA 方法有：间接法，双抗体夹心法和竞争法等。本实验采用间接法测定单克隆抗体效价。

间接ELISA

实验步骤

1. 包被特异性抗原：固体抗原用包被液稀释至100μg/ml，于96孔板每凹孔加100μl，加盖置4℃过夜。次日倾去凹孔内液体，用滴管取洗涤液在每孔中加满稀释/洗涤液3次，首次洗涤静止2min后倾去，后两次静置1min。将反应板扣在滤纸上，以除净液体。



2. 封闭：每孔中加满封闭液（约300μl多），加盖或用封口膜封板，置37℃恒温箱60min，倾去孔内液体，按上法洗涤3次。
3. 加待测抗体、空白对照（PBS/Tween）：将待测抗体按倍比法用稀释液稀释（1:100,1：200,1:400等），取不同稀释度的待测抗体及空白对照各100μl加至相应的凹孔中，加盖或封板，置37℃恒温箱1h，使抗体与固相抗原进行特异性结合，反复洗涤3次。



4. 加酶标抗体：加入HRP标记二抗，每孔加100μl，封板后置37℃温育1h，按上法至少洗涤5次，最后用蒸馏水洗涤2次，扣在滤纸上吸干水分。
5. 显色：首先按每10mlOPD加入15mlH₂O₂处理。每孔加入OPD应用液100μl、反应板置室温暗处5~30min。当明显显示黄色时及时终止反应。
6. 终止反应：每孔加入100μl 2mol/l H2SO4。由黄色变为橙色。稳定3~5min即可比色测定。
7. 检测：用酶联免疫测定仪，测波长为490nm时各孔的光吸收
8. 计算：计算待检抗体与空白对照习惯度比（Positive/negative，P/N），当P/N大于2时为阳性，P/N小于2为阴性，取稀释倍数最大的阳性结果为测得的抗体效价。

注意事项

1. 聚苯乙烯微量反应板应选择高质量、非特异性吸附小的产品。包被物应具有较高的纯度，其浓度一般在1~1ug之间，在偏碱性条件下易吸附于反应板的凹孔中。
2. 反应各步均应充分洗涤，以出去残留物，减少非特异性吸附。为使结果重复应固定洗涤次数及放置时间，切忌相互污染。
3. 为使显色反应便于比较，显色后置室温暗处的时间应一致，终反应3~5min后应立即比色。必要时可设阳性对照，以固定显色及终止时间。