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体外诊断试剂原料评估指标
--抗体诊断原料

抗体作为主要的体外诊断试剂核心原料对于整个免疫检测分析系统有着至关重要的影响。衡量抗体诊断原料质量的技术指标没有统一的标准,一般以活性/效价/亲和力、线性范围、特异性、纯度、重复性/批间差和稳定性等作为抗体诊断原料的评估指标。

活性/效价/亲和力

活性/效价/亲和力是反应抗体与抗原之间反应性的直接指标。
大多数抗体供应商对于效价的检测是利用直接/间接ELISA方法测定抗体与重组或者天然抗原反应,通过信号值对抗体诊断原料的活性进行考察。但是需要注意,并不是高亲和力的抗体就一定对应为高性能的免疫检测分析系统。不同种类的标志物对于亲和力的要求有一定区别,具体讨论将在线性指标中详细展开讨论。

线性范围

线性范围是指分析方法在给定范围内获取与样品中待测物浓度成正比的试验结果的能力,是反映分析方法检测范围和准确性的直接指标。线性范围的确定需要再预期范围内选择7-11个浓度水平,然后依据实验结果逐渐减少数据点直至表现出线性关系,可发现最宽的线性范围。
在活性/效价/亲和力描述中提到,高亲和力抗体诊断原料并不代表高性能试剂,针对不同种类的标志物,对于亲和力的需求有一定差异。这是因为有些待测标志物在体内的浓度范围很宽,(如人绒毛膜促性腺激素(HCG)、肌红蛋白(MYO)C反应蛋白(CRP)等)如果是高亲和力的抗体,那么会导致钩状效应的过早出现,提前进入平台期而引起信号下降,影响试剂盒的线性范围,导至了高浓度样本被严重低估,甚至可能导至医疗事故的产生。但是对于含量很低就能预示疾病且浓度范围不宽的标志物,(如肌钙蛋白(TnI)和降钙素原(PCT)等)高亲和力的抗体就具有检出低值样本的能力,也相应提高了检测的灵敏度。

特异性

指抗体单一性识别某种特定抗原的能力。如何能在混合物中识别特定的抗原也是评估抗体的重要指标。特异性虽然不直接影响试剂整体反应性,但是却对于检测结果有着很重要的影响。
血清中除了待测标志物之外,还存在许多其他分子。这些分子可能和待测物具有类似的结构或构象;也可能与待测物存在共同的氨基酸片段。当抗体所识别的表位也存在于其他分子中时,便会导至测试结果的假阳性或者假阴性。如心肌肌钙蛋白(cTnI)和骨骼肌肌钙蛋白(sTn)直接存在多段相同的氨基酸序列;促甲状腺激素(TSH)、促卵泡生成激素(FSH)、促黄体生成激素(LH)和人绒毛膜促性腺激素(HCG)存在共同的α亚基等。肌红蛋白(MYO)与血红蛋白均具有血红素核心、地高辛和洋地黄毒苷具有类似的糖苷结构、糖抗原CA50和CA19-9均有Lewis-A糖抗原等。这既是抗体诊断原料特异性差所导至的结果,也可以理解为抗体识别的抗原表位不够专一所致。因此,抗体的识别位点是决定抗原特异性的关键性因素。

纯度

抗体的纯度测定主要有SDS-PAGE电泳后的条带扫描和HPLC测试等。以proteinA/G亲和纯化的方法可以获得较高纯度的抗体。
在体外诊断试剂制备过程中,抗体标记效率与抗体的纯度有关。当抗体纯度较低时,会导致抗体与其他杂蛋白被一起标记,从而影响了试剂的反应性能,如特异性、反应信号、背景值等。抗体的纯度通常由细胞培养工艺和抗体纯化工艺所决定。使用无血清培养基可以很大程度上去除血清培养基中带来的杂质蛋白,而蛋白质纯化工艺则可以进一步将抗体中绝大多数杂质去除。

重复性/批间差

是指每批次产品的可重复性。之前所述的一系列抗体性能对于体外诊断试剂的性能有直接影响,而重复性则是保证体外诊断试剂降低批间差异并且稳定生产的前提条件。另外,如前所述,重复性和生产工艺密切挂钩,因此也是体现抗体诊断原料质量的关键指标。查看更多

稳定性

是指在特定的储存条件下,一定时间内抗体保持其活性的能力。在抗体修饰/偶联前的稳定性是抗体真实的稳定性,修饰/偶联后的抗体稳定性主要取决于制备工艺。抗体诊断原料的保存条件对于抗体的稳定性至关重要,目前多数供应商提供的抗体的储存条件为4或-20℃;常规抗体的稀释液大多数为不含有其他蛋白和保护剂的缓冲液(抗体中若含有其他蛋白或者保护剂,会影响抗体的后续偶联)。
对于37℃加速稳定性,有企业认为,试剂在37˚C放置3d相当于4˚C放置半年,37˚C放置7d相当于4˚C放置1年,半年的加速稳定性研究后可以将产品效期稳定性定为2年,这些说法是缺乏科学依据的。由于体外诊断试剂结构组成比较复杂,可能同时存在多种降解途径,不同条件下的降解、聚合、变性、失活,以及与包装材料之间的相互作用等各不相同,所以一般情况下,加速稳定性研究只能用于产品一般性能研究,不能用于推导产品有效期。查看更多
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