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时间分辨荧光

免疫荧光是一种将抗原抗体结合反应与生物标记技术相结合的技术,在科研及临床上有着广泛的应用。普通的免疫荧光技术在对抗原含量进行测定时存在一定的局限性,在生物流体和血清中的许多复合物和蛋白本身就可以发荧光,用普通荧光素来检测生物样品时,蛋白质本身产生的荧光会对实验产生干扰,实验检测的灵敏度严重下降。为了解决这一问题,1983年SOINI和KOJOLA提出以镧系元素标记为示踪螯合物和荧光测量相结合,建立了时间分辨荧光分析技术。时间分辨方式的免疫荧光分析方法可以对蛋白质、酶以及同位素等物质进行标记,并且不再受检测物种自然荧光的干扰。

技术原理

镧系元素共有15中,常用的有4中:钐(SM),铕(Eu),镝(Dy),锝(Te)。镧系元素的半衰期很长(介于10-1000us之间,背景物质的半衰期为1-10ns),利用镧系元素的荧光特点,通过延长检测时间,在待测样品中短寿命的自然荧光完全衰变后再进行检测,即可将特异性荧光与非特异性荧光分辨开来。

荧光信号衰变时间对比

图1:荧光信号衰变时间对比

在POCT领域,免疫荧光平台最常用的就是时间分辨免疫荧光,其实验原理如下:当将含有待测抗原(抗体)的样品滴在加样区,待测样品中的抗原(抗体)与结合垫中的荧光纳米微球标记的抗体(抗原)结合并通过毛细作用向前层析,当达到检测区后,与检测线上固定的抗体(抗原)结合,形成微粒-抗体-抗原-抗体夹心复合物并被固定在检测线上,而多余的荧光微球标记物继续向前层析,与固定在质控线二抗结合。反应结束后,用紫外光源(365nm)对检测区扫描检测,检测线和质控线上荧光纳米微球发出高强度的荧光(615nm),且衰变时间也较长。延缓测量时间,待样品基质中自然发生的短寿命荧光(1-10ns)全部衰变后,再测量稀土元素的特异性荧光。通过检测线和质控线荧光强度的强弱及其比值,即可分析出样品中待测物的浓度。

时间分辨荧光技术原理

图2:时间分辨荧光实验原理

镧系元素特点

时间分辨荧光免疫分析法之所以能够继酶免、放免、化学发光、电化学发光后成为一种更新、更灵敏的检测方法,主要取决于它用镧系元素物理及化学性质。

寿命长

镧系元素拥有极长的荧光衰退时间(例如铕元素衰退时间为730000ns,钐元素衰退时间为50000ns),通过延长检测时间即可消除实验的本底干扰。

Stockes位移大

StoKes位移是指激发光谱与发射光谱之间的光谱波峰的波长差。波长差越大,越容易将两个波长区分开来,排除干扰。例如铕的激发光波长340nm,发射光波长613nm,两者之间的波长差为273nm,所以激发光和发射光很容易用干涉滤光片分靠。而普通荧光物质的激发光与发射光之间的波长差为28nm,那就很难排除激发光对发射光的干扰,影响检测结果。

特异性强

镧系元素的发射光谱很窄(615±5nm),狭窄的发射峰,通过波长分辨,很容易将特异性与非特异性荧光分辨开来。

时间分辨荧光平台优势

  • 灵敏度比普通免疫荧光平台高,检测范围广

  • 标准曲线近似一条直线,结果更加准确

  • 线性范围宽

  • 试剂批间差小

时间分辨荧光临床应用

甲状腺功能检测:TSH,ultraTSH,T3,T4,FT3,FT4等
性激素类检测:FSH,LH,HCG,SHB,Prog等
肿瘤标记检测:AFP,CEA,PSA,hTG,β2Micro,PAP等
传染性疾病:HBsAg、HBsAb、HBeAg等
炎症类疾病:SAA、CRP、PCT、IL-6等
心血管类疾病:cTnI,NT-proBNP等
代谢类疾病:HbA1c等

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