D-二聚体（D-Dimer）免疫检测及其影响因素

D-二聚体是一种可溶性纤维蛋白降解产物，源自纤溶酶介导的交联纤维蛋白降解。因此，D-二聚体可以被认为是凝血和纤维蛋白溶解激活的生物标志物，通常用于排除静脉血栓栓塞（VTE）。D-二聚体越来越多地用于评估VTE复发风险，帮助确定VTE患者抗凝治疗的最佳持续时间、诊断弥散性血管内凝血以及筛查VTE风险增加的患者。

1.D-二聚体检测方法

1.1 多克隆抗体检测

20世纪70年代开发的第一代D-二聚体检测法，能够通过多克隆抗体检测纤维蛋白原和FDP。为了避免血浆中高浓度纤维蛋白原的交叉反应，这种免疫测定只适用于血清样本；而且服用抗凝剂的患者会出现假阳性结果，在形成凝块以及降解产物被吸收到凝块中的样本会出现假阴性结果。

1.2 单克隆抗体检测

20世纪80年代初，随着针对D结构域单克隆抗体的引入，D-二聚体检测的特异性和灵敏度显著提高。这代免疫测定可以特异性靶向D-二聚体表位，与FDP和纤维蛋白的非交联片段的交叉反应性极小，因此可以使用血浆样本。第一代方法主要以定性乳胶凝集免疫测定法为代表，使用抗体包被的乳胶微粒并需要目视检查凝集反应。第二代自动化乳胶凝集免疫测定（或乳胶增强免疫比浊测定）通过D-二聚体的聚集率来定量D-二聚体。添加D-二聚体后，乳胶微粒凝集，从而阻止光穿过溶液。光度计测得吸光度的增加与D-二聚体浓度成正比。乳胶增强免疫比浊测定速度快，灵敏度与传统酶联免疫吸附测定（ELISA）相当。

1.3 酶联免疫荧光分析

20 世纪 90 年代中期，bioMérieux开发了一种基于ELISA的荧光终点检测分析（酶联免疫荧光分析（ELFA））。该测定显示出与微孔板ELISA类似的灵敏度和特异性，具有自动化优势，可以在更短时间（30分钟）内产生更精确的结果。Vidas^®是临床上最有效的D-二聚体测量技术，是公认的商业参考方法。

1.4 化学发光酶免疫分析

最近，化学发光酶免疫测定法显示出与ELISA和乳胶增强免疫比浊测定法相似的敏感性。磁微粒包被特异性D-二聚体单克隆抗体，用异鲁米诺标记的抗D-二聚体抗体孵育，产生与D-二聚体浓度成正比的化学发光反应。

1.5 POC D-二聚体检测

POC D-二聚体测定能够快速筛查患者的血栓栓塞性疾病，从而缓解急诊压力，且便于农村地区使用。大多数POC检测使用全血，周转时间（TAT）短。在血凝试验中（如：SimplyRED^®），二价抗体对红细胞和D-二聚体具有特异性。当血液中存在D-二聚体时，红细胞发生凝集并提供定性结果。基于免疫层析（如Clearview Simplify^®）、荧光（如Vidas^®迷你分析仪、Triage^®、Stratus CS^®）和化学发光（如Pathfast^®）的检测方法也存在。一些半定量检测也在使用（如Dade Dimertest，NyoCard^®）。

表1. D-二聚体测定的特点

2.影响D-dimer检测的因素

2.1 分析前变量

在止血实验室中大多错误与分析前活动有关，分析前错误出现的频率为60-70%，这远高于分析阶段（10-15%）和分析后阶段（15-20%）。分析前错误主要集中在人工操作环节。

Salvagno等人研究了当地凝血实验室2年间检测到的所有分析前错误；发现最常见的分析前问题与实验室未收到样本（49.3%）、溶血（19.5%）、凝血（14.2%）和样本量不足有关（13.7%）。Grecu等人研究发现，血液学实验室分析前错误43.2%来源于凝血样本。Dikmen等人在为期1年的类似研究中，发现拒收样本主要源于样本凝固（35%）和体积不足（13%），且凝血测试样本拒收率（13.3%）高于其他测试（例如生化测试为3.2%，血气分析为9.8%，尿液分析为9.8%）。

2.1.1 止血带

止血带通常用于暂时阻塞静脉血流，帮助抽血医生识别静脉通路。通常建议，针头进入静脉或第一根管子开始充满时，立即取下止血带，止血带停留时间不超过1-2分钟。长时间使用止血带会引起血液浓缩和形成凝块，影响凝血检测结果。Lippi等人观察到，在静脉停滞3分钟后采集的样本中，D-二聚体值（Mini Vidas^®免疫分析仪）增加13.4%。静息1分钟后平均增加7.9%。

2.1.2 抗凝剂

临床实验室标准研究所（CLSI）和世界卫生组织（WHO）建议在绝大多数止血测试中使用含有3.2%（105-109 mmol/L）缓冲柠檬酸钠抗凝剂的采集管，不建议使用肝素化/EDTA等会显著干扰凝块测定（例如 PT、APTT、FV、FVIII）的抗凝剂。血液与抗凝剂的推荐比例为9/1，异常抗凝比例通常会延长凝血时间（PT、APTT 和 TT），导致D-二聚体和纤维蛋白原估值偏低。

一些商业化D-二聚体检测（包括POC检测）允许使用柠檬酸盐、肝素化或EDTA血浆（Pathfast^®、Tina-quant^®（罗氏，瑞士）、AQT-90^®（Radiometer，丹麦）、Simplify^®（Agen Inc，澳大利亚）），而其他厂家则建议仅使用柠檬酸盐抗凝血液（例如 Vidas^®、BCS^®、STA-Liatest^®（Diagnostica Stago，Asnières，法国）、Immulite^®（西门子，美国）。

2.1.3 溶血

体外溶血是临床实验室分析前问题最常见的原因之一。患者自身（例如溶血性贫血、代谢紊乱、传染源）、抽血（例如针头尺寸、止血带时间、外伤性抽血、未混合或剧烈混合血管）、样品运输（例如PTS、时间、急或重症监护病房）、处理（例如离心前延迟、样本重旋、运输时间/温度）和储存（例如温度和持续时间）都可能造成溶血。CLSI指南H21-A5（血浆凝血试验和分子止血试验血液标本的收集、运输和处理）建议不要使用可见溶血的样品，因为损伤细胞释放的促凝因子可能造成实验偏差。临床实验室的大部分溶血标本（±95%）仅为轻度溶血（无细胞血红蛋白0.3-0.6 g/L）。因此，当游离血红蛋白浓度低于非干扰限度（即< 3g /L）时，D-二聚体值可能仍然是可靠的。

2.1.4 稳定性与储存

虽然D-二聚体主要用于急诊和快速测量；但当样品储存在中心实验室以及在研究环境中使用时，需要稳定性信息。多项研究表明D-二聚体可能会稳定较长时间，目前建议测试前样品在室温（15-25℃）下保存不超过4小时。在许多不同的D-二聚体免疫测定中，D-二聚体在室温（RT）或2-8℃下可稳定至少24小时（在血浆/全血中）。此外，有研究表明，冻融程序不会显著影响D-二聚体检测结果。

2.2 分析变量

2.2.1 方法间差异

D-二聚体检测目前的主要问题就是免疫测定法之间的高度差异性。这种差异与以下几个因素有关：1）D-二聚体包含交联纤维蛋白降解产物的广泛混合物，2）使用不同的单克隆抗体，3）缺乏国际认证的内控或校准品，以及4）单位和临床界值的使用差异。

2014年，美国病理学家学会（CAP）凝血资源委员会在一项涉及3800个实验室的调查中发现，方法间变异系数（CV）高达42%。根据UKNEQAS的四份报告（2017年4月、2017年7月、2017年9月和2018年1月），非FEU和FEU单位的方法间CV（排除异常值后）分别为33.4%、38.2%、41.8%、30.9%和18%、19.3%、17.7%和19%；这四项调查涉及736至752个实验室。

2.2.2 校准品

校准材料主要通过纤维蛋白凝块的可控裂解获得。因此，制造商必须确保裂解是可重复的，以获得相同大小的降解产物，因为检测的灵敏度可能会根据高分子量纤维蛋白原（HMWF）或低分子量纤维蛋白原（LMWF）的相对量而变化。D-二聚体测定可用纯化的纤维蛋白片段D-二聚体等同物，或根据用于制备校准品的纤维蛋白原量进行校准。

2.3 分析后变量

2.3.1 计量单位

D-二聚体单位根据所用校准品的类型而变化，目前临床实验室使用两种单位：D-二聚体单位（DDU）和纤维蛋白原当量单位（FEU）。FEU将D-二聚体的质量与纤维蛋白原的质量进行比较，校准品是通过纤溶酶降解纯化的纤维蛋白原（存在因子XIII的情况下凝固）制备的。DDU是确定的D-二聚体质量，校准品由纯化的D-二聚体组成。最近的研究表明，大多数临床实验室使用FEU计量，主要测量单位是mg/L，其次是ng/mL。在可用的测量单位中，μg/L（或ng/mL）最接近国际系统（SI）的单位。需要注意的是使用不同的单位（FEU或DDU，以及不同的测量单位）可能会造成混乱，并导致患者的分类错误或误诊。

2.3.2 年龄cut off值

D-二聚体值通常随着年龄的增长而增加，大部分老年患者的D-二聚体水平高于500μg/L FEU的传统cut off值。现在普遍建议使用年龄调整cut off值（即[年龄调整cut off值，μg/L FEU] = [年龄（岁）×10]）来报告D-二聚体检测结果。使用特定的年龄cut off值能够大幅提高阳性预测值（PPV）。

2.3.3 周转时间

周转时间（TAT）是D-二聚体报告的一个关键方面，因为D-dimer检测主要用于紧急临床情况。意大利共识文件推荐总体TAT<1小时，这似乎适用于管理绝大多数紧急测试请求。建议使用线性范围宽（即高达5000µg/L），且不进行额外稀释的测定法，以及使用更快且经过验证的离心过程、气动管道系统（PTS）或可靠的POC分析仪，以减少TAT。

3. 关于D-二聚体检测的建议

由于不同的D -二聚体免疫检测（即形式、抗体）的异质性和缺乏标准化，在实施静脉血栓栓塞管理策略之前，应评估当地方法的分析和临床性能。用于排除VTE的cut off值需要在当地确认，根据英国血液学标准委员会指南的建议，使用至少200名受试者。可以使用制造商建议的cut off值，前提是已在其他地方进行了可靠的验证研究，并且未发现显著的批间差异。许多检测方法（例如 Vidas、AxSYM、STA-Liatest）的cut off值已在前瞻性研究中得到临床验证。在选择制造商时，应考虑此因素。另外，制造商应及时了解有关其免疫测定法使用的最新文献，在需要时更新cut off值。

D-二聚体检测的是具有不同分子量的交联纤维蛋白降解产物的混合物，不应与纤维蛋白原或FDP反应。最好也不要与各种酶介导的蛋白水解释放的纤维蛋白和纤维蛋白原片段反应。

参考文献

Favresse J, Lippi G, Roy PM, et al. D-dimer: Preanalytical, analytical, postanalytical variables, and clinical applications[J]. Crit Rev Clin Lab Sci, 2018, 55(8): 548-577.

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