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体外诊断用抗体的结构与分类


抗体是体外诊断(IVD)行业必不可少的核心原料,可以作为标记/检测抗体、包被/捕获抗体、独立C抗体、二抗等。抗体是由抗原刺激分化产生的浆细胞所分泌的免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)。一方面,抗体可以特异性地结合抗原,这样的结合可以使病原或者毒素类抗原失去活性;另一方面,抗体在和抗原结合后,可以引发后续的一系列免疫反应,参与对抗原的清除。抗体全部属于免疫球蛋白,但不是所有的免疫球蛋白都是抗体。本文针对体外诊断(IVD)行业应用的核心原料——抗体,对其结构与分类进行阐述。

抗体的基本结构

抗体单体呈“Y”字形,包含两条相对分子量较大的重链(分子量50~70 kDa)和两条相对分子量较小的轻链(分子量约25 kDa),链之间通过二硫键或非共价键连接。轻链和重链均由一系列的结构相似的Ig结构域重复连接组成,每一个Ig结构域内大约含有110个氨基酸残基。抗体的一条轻链包含2个Ig结构域(VL和CL),一条重链包含4~5个Ig结构域(VH、CH1、CH2、CH3、(CH4)),CH1和CH2之间一般通过铰链区(hinge)连接。同一物种不同抗体的C端几乎相同,这段区域称为恒定区(C区),N端被称为可变区(V区)。

抗体的轻链和重链都包含可变区和恒定区,轻链的可变区占全长的一半。可变区中存在可以与抗原特异结合的位点,抗体的两条“Y”臂可以分别和一个抗原分子结合。可变区上存在三个序列高度变化的区域,称为高变区(hypervariable region,HVR)或互补决定区(complementarity determining region,CDR)。CDR区域序列的高频变异决定了结合不同抗原的抗体种类和特异性。抗体的两个独立的完整的“Y”臂(轻链全长+重链的VH、CH1片段)称为抗原结合片段(antigen-binding fragment, Fab),是和抗原结合的区域;“Y”的柄部称结晶片段(crystalline fragment, Fc),Fc段则包含了所有抗体分子共有的蛋白质序列以及独特的受体结合位点,决定着抗体如何和其他体液免疫分子作用。

抗体单体结构

图1. 抗体单体结构

抗体分类和免疫功能

抗体的轻链分为κ和λ两种结构,重链分为α、δ、ε、γ以及μ五种结构。根据抗体重链的不同,大致可以将Ig分为IgA、IgD、IgE、IgG和IgM五类。任何一种抗体都可以存在κ和λ两种结构轻链,但一株抗体只含有这两种轻链中的一种。

IgA:IgA的重链为α型,铰链区较短。在人体中IgA有IgA1和IgA2两种亚亚型,IgA2较 IgA1的铰链区稍长,且比较耐受细菌分泌的蛋白酶。按存在形式IgA可以分为单体、二聚体;按存在部位可以分为血清型(分子量160 kDa)和分泌型(分子量600 kDa),其中分泌型的IgA一天大约会产生40mg/kg,是人体中产生数量最多的抗体。单体和二聚体形式的IgA仅存在于血清中,半衰期7天,可以触发补体系统;分泌型的IgA由二聚体和分泌片组合成,为黏膜上皮细胞分泌,是黏膜免疫系统的重要成员。当患上类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、肝硬化及某些感染性疾病时,IgA水平升高;当发生自身免疫病、烧伤或输血时,IgA水平降低。

IgD:IgD的重链为δ型,分子量180 kDa,含有较长的铰链区,以单分子形式存在于血清中,半衰期为2天,是B细胞表面关键的受体分子,参与B细胞的激活。当患上结核病、麻风、骨髓炎、化脓性皮肤病或恶性营养不良等时,IgD水平升高;原发性免疫功能缺陷或重度复合性免疫功能缺陷患者IgD水平降低。

IgE:IgE的重链为ε型,无铰链区,分子量约190 kDa,含一个CH4结构域,是单体的分泌型抗体,主要存在于黏膜系统;血清IgE半衰期为2天,浓度非常低。IgE和许多过敏性疾病的发生相关,过敏性鼻炎、过敏性皮炎、湿疹等超敏反应会引起IgE水平升高。

IgG:在体外诊断(IVD)行业应用比较多,作为试剂盒研发的核心原料。IgG分子量150 kDa,IgG的重链γ型可以细分为不同的亚型:γ1, γ2, γ3, 和 γ4, 在人体中对应的IgG的亚亚型为IgG1, IgG2, IgG3, 和IgG4,是结构和功能上被研究的最为深入一类抗体。IgG的亚亚型之间最大的结构差异存在于铰链区。IgG3的铰链区是Fc长度的二倍,致使Fab片段远离Fc片段;IgG2/IgG4的铰链区较短,在结构上使Fab片段和Fc片段靠的较近。在经受抗原刺激后,IgG的产生时间仅次于IgM,是体液免疫反应中发挥主要作用的抗体。IgG半衰期为21天,是血清中浓度最高的抗体分子,占免疫球蛋白含量的70%,也是唯一一类能够穿过胎盘为新生儿提供母体免疫的抗体分子。血清IgG含量正常参考值为7.0~17.0g/L,IgG水平的变化提示系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、肌紧张性营养不良等疾病风险。

IgM:IgM的重链为μ型,含有4个CH结构域,一个额外的CH2代替了铰链区。IgM在体内存在两种形式:血清中的IgM为分泌型的五聚体,分子量约900 kDa,半衰期7天,可以高效的触发补体系统;B细胞膜上IgM以膜结合型的单体形式(分子量约160 kDa)存在,是B细胞识别抗原的主要受体。IgM是迄今为止实际发现的在人体循环系统中的最大抗体,也是接触抗原首先发生反应的第一抗体。在体液免疫的早期阶段IgG数量不足,主要由IgM发挥清除病原的作用;当再次遭遇外来抗原后,IgM在血液中的浓度会迅速下降。因此,IgM通常作为初次感染的指标。

常见抗体类型

图2. 常见抗体类型

动物特有的抗体

IgY: 可以作为体外诊断(IVD)试剂试纸条独立C线的原料。卵黄抗体IgY是鸟类、爬行类和两栖类动物的特有抗体,分子量180 kDa,结构和功能上类似于哺乳动物的IgG。与IgG相比,IgY的重链没有铰链区,而是由1个可变区(V区)和4个恒定区(CH1~CH4)组成。由于结构上的差异,IgY不会与哺乳动物的Fc受体结合,也不会与哺乳动物来源的其他抗体发生交叉反应,被广泛应用于体外诊断领域。

HCAbs和VHH:HCAbs是在骆驼科动物中发现的特殊抗体,结构上缺失轻链和重链的CH1,仅含有重链可变区VHH和CH2、CH3区,被称为重链抗体(分子量90 kDa)。单独克隆并表达出来的VHH结构具有与原重链抗体相当的结构稳定性以及与抗原的结合活性,大小接近纳米级别(15 kDa),是已知的可结合目标抗原的最小单位分子,被称为纳米抗体。VHH可溶性极高,不易聚集,能耐高温、强酸、强碱等致变性条件,适合于原核表达和各种真核表达系统,广泛用于治疗性抗体药物开发、体外诊断(IVD)试剂研发等领域。

IgNAR:IgNAR在鲨鱼体内被发现,分子量约130kDa,和HCAbs一样缺乏轻链。和HCAbs不一样的是,IgNAR有分泌型和膜结合型两种存在形式,分泌型IgNAR分子的重链包含1个可变区(VNAR)和5个恒定区(CH1~CH5)。VNAR的分子量12 kDa左右,比VHH小约20%,是目前已知动物界最小的天然抗原结合域。IgNAR还具有稳定性好、亲和力高、可溶性强、组织穿透能力强、免疫原性低和易于人源化改造等优点,种种优势使其在疾病诊断等领域受到广泛关注。

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