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胶体金实验影响因素

对于产业化应用的抗原、抗体诊断原料,大多都可以满足胶体金检测平台的要求,但是由于体外诊断(IVD)试剂原料产品质量参差不齐,很多IVD原料供应商不会对自己的抗原/抗体诊断原料是否可以应用于胶体金平台而进行验证。相对来说,胶体金方法对抗原、抗体诊断原料的要求是比较高的,因为不管是胶体金标记还是NC膜包被都是基于物理吸附作用,这种结合过程是相对脆弱的,很容易受到干扰。本文主要对与抗原/抗体有关的胶体金实验影响因素做一介绍。

1. 蛋白纯化方法

镍柱纯化:重组抗原/抗体通常带有his等标签,通过镍柱纯化得到的抗原/抗体诊断原料含有大量的咪唑。微量的咪唑足可以使胶体金聚集、死金、沉淀,而且以包涵体形式表达的蛋白,往往需要高浓度的尿素来溶解,尿素对胶体金的破坏也是非常严重的。

硫酸铵沉淀或DEAE纯化:硫酸铵沉淀或DEAE纯化的血清含有大量的可竞争性结合胶体金颗粒表面结合位点的杂蛋白,产生的强电解质和高盐成分,从而影响检测分析的结果并降低检测分析的灵敏度。

ProteinA/G纯化:如果采用A蛋白或G蛋白柱层析纯化小鼠腹腔血清抗体作为胶体金结合物标记原料,由于抗体原料中含有大量的非特异性的小鼠本身IgG,导致胶体金结合物中含有大量非特异性的胶体金结合物,从而降低检测分析的灵敏度。而重组抗体则会避免小鼠自身的IgG,且纯度较高。

解决方法:如果抗原、抗体存在上述干扰物质,建议可以通过超滤或者透析去除。很多人反馈在透析重组抗原/抗体诊断原料的时候,很容易产生大量的沉淀,特别是包涵体抗原。主要原因是透析液不太合适,应选择尽量偏离蛋白等电点的pH缓冲液,如果不确定蛋白的等电点,建议用20mM Tris-HCL(8.5)或者20mM Tris-甘氨酸(8.5)来做透析液,适用于绝大部分的抗原抗体原料。

2. 抗体亚型

单克隆抗体需要特别注意的是,不同的单抗类和亚型对胶体金标记的影响。一般来讲,IgG1亚型标记效果最好,其它亚型和类或多或少存在一定的局限性,但是我们经常会筛选到IgG2a、IgG2b这些亚型,甚至偶尔会遇到IgM、IgA,此时,这些最好用于NC膜的包被,绝大部分的亚型和类包被NC膜都没有问题。如果确实需要用于胶体金标记,建议有条件使用(如高标记pH,低标记量,强封闭)。

3. 蛋白纯度

在体外诊断试剂制备过程中,抗体标记效率与抗体的纯度有关。当抗体纯度较低时,会导致抗体与其他杂蛋白被一起标记,从而影响了试剂的反应性能,如特异性、反应信号、背景值等。抗体的纯度通常由细胞培养工艺和抗体纯化工艺所决定。使用无血清培养基可以很大程度上去除血清培养基中带来的杂质蛋白,而蛋白质纯化工艺则可以进一步将抗体中绝大多数杂质去除。

4. 保存液

在蛋白的保存过程中,可能会加入一些甘油、蔗糖之类的物质作为保护剂,而这些保护剂由于其强亲水性,对抗原/抗体诊断原料的胶体金标记和包被都会产生不利影响。

比较理想的抗原、抗体保存液:10mM/20mM PB(7.4~8.0)、10mM/20mM PBS(7.4~8.0)、20mM Tris-HCL(8.0~9.0)、20mM Tris-甘氨酸(8.0~9.0)。另外,可加入适量防腐剂,如:0.1%~0.5%叠氮钠,不推荐使用ProClin300防腐,ProClin300对胶体金标记会有一定程度的影响,虽然这种影响并不是很严重,但是有潜在的风险。

胶体金检测常见问题分析

(1)在检测中,C、T线颜色不一致,检测结果如何判断?

若是消线法,只要C,T线在规定时间内都显色,不管颜色是否一致,就可判为阴性,T线不显色则判为阳性。

若是比色法,T线比C线深,判为阴性,T线比C线浅或T线不显色,则判为阳性。

对于夹心法产品,只要C,T线在规定时间内都显色,就可判为阳性,T线显色越深,表示阳性越强。

(2)在使用检测卡过程中,能否用水或者其他液体作为阴性样本对照?

不能。一方面因为检测样本成分很复杂,用水作为阴性对照没有参考意义。另一方面不同的产品检测体系不同,用水作对照容易造成假阳或漏检等现象。

(3)不同厂家的检测卡作比较时,能做几份标本就下结论判断哪家产品好吗?

不能。判断试纸条主要的指标有灵敏度、特异性、稳定性、精密度等指标,其中灵敏度和特异性是最关键的。灵敏度的考评就需要由不同样本做添加,还需要由高浓度的阳性样本做倍比稀释。特异性也需要做不同区域和特殊样本的检验。因为不同厂家的检测条虽然原理是相同的,但原料来源不相同,做几份是不能反映检测条的综合性能指标。

(4)样品层析速度慢或者不发生层析

原因分析:

加样量太少

样本过于粘稠

试纸条失效

建议处理方案

增加加液量或滴加少量辅助液

滴加少量辅助液,对样本进行预处理以去除沉淀物

更换新试纸条重新检测,试纸条现拆现用

(5)测全血时,有大量的全血样本析出,NC膜背景偏红,影响结果判读

原因分析:

该试纸条NC膜严重受损或断裂

使用已溶血的全血标本

建议处理方案

更换新试纸条重新检测

尽量使用新鲜全血检测

(6)漏检率偏高

原因分析:

检测时间太短,判断结果过早

加样量太少,辅助液滴加过量,样本被稀释

样本中被检物浓度太低

个别样本中含有较为特殊物质,样本的pH值过高或过低

该试纸条受潮,活性下降或失活

建议处理方案

按说明书要求正确判读,建议对于较弱性或阴性样本可延迟

按说明书要求正确加样或辅助液

采用其他检测方法进行确认

(7)检测结果假阳性率高

原因分析:

该试纸条灵敏度偏高

该样本含有特殊干扰物或已被污染

在规定时间后判读结果

建议处理方案

提前判读结果或更换新检测卡重新检测

用其他检测方法确诊检测结果,确保样本不受污染

按说明书要求正确判读结果,超出判读结果的时间范围,结果不准确

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