免疫比浊法测定糖化血红蛋白含量

成人的血红蛋白（Hb）通常由HbA（97%）、HbA2（2.5%）和HbF（0.5%）组成。HbA又可分为非糖化血红蛋白，即天然血红蛋白HbA0（约90%）和糖化血红蛋白HbA1（约5-7%）。根据糖化位点和反应参与物的不同，HbA1可以进一步分为HbA1a、HbA1b、HbA1c等亚基组分。其中HbA1c占HbA1的80%，化学结构为具有特定六肽结构的血红蛋白分子。其形成过程是血红蛋白β链N端缬氨酸与葡萄糖的醛基首先发生快速反应形成不稳定的中间产物醛亚胺（西佛氏碱），继而经过Amadori转位，分子重排缓慢形成稳定不可逆的酮胺化合物，即HbA1c。HbA1c浓度相对恒定，故临床常用HbA1c代表总的糖化血红蛋白水平，能直接反应机体血糖水平，是临床监控糖尿病患者血糖控制水平的较好的检测指标。

糖化血红蛋白测定方法多达60多种，主要分为两类：1. 基于电荷差异的检测方法，包括离子交换层析、高校液相色谱分析和电泳法等；2. 基于结构差异的检测方法，包括亲和层析和免疫法等。目前临床上应用比较多的是免疫比浊方法及HPLC法，本文主要就免疫比浊法测定糖化血红蛋白含量做一介绍。

原理

利用TTAB（Tetradecyl trimethyl ammonium bromide，四癸基三甲胺溴化物）作为溶血剂，用来消除白细胞物质的干扰（TTAB不溶解白细胞）。血液样本不需要去除不稳定HbA1的预处理,用浊度抑制免疫学方法测定。
先加入抗体缓冲液,样本中的糖化血红蛋白（HbA1c）和其抗体反应形成可溶性的抗原-抗体复合物,因为在HbA1c分子上只有一个特异性的HbA1c抗体结合位点,不能形成凝集反应。然后,加入多聚半抗原缓冲液,多聚半抗原和反应液中过剩的抗HbA抗体结合,生成不溶性的抗体-多聚半抗原复合物,再用比浊法测定。
同时在另一通道测定Hb浓度,溶血液中的血红蛋白转变成具有特征性吸收光谱的血红蛋白衍生物,用重铬酸盐作标准参照物,进行比色测定Hb浓度。
根据Hb含量和HbA1c含量,计算出HbA1c的百分比。

试剂

1. HbA1c测定试剂

(1)R1试剂:0.025mol/L MES（2- morpholinoethanesulfonic acid,2-吗啉乙基磺酸）缓冲液；0.015mo/L Tris缓冲液（pH6.2）；HbA1c抗体和稳定剂；
(2) R2试剂:0.025mol/L MES缓冲液；0.015mo/ L Tris缓冲液（pH6.2）；HbA1c多聚半抗原（≥8μg/ml）和稳定剂.
(3)标准液:人血和绵羊血制备的溶血液,9g/L TTAB和稳定剂。

2. Hb测定试剂 0.02mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4）和稳定剂。

3. 溶血试剂 9g/L TTAB溶液。

4. 质控物正常值或异常值两种。

5. 9%NaCl。

操作

于小试管中,加溶血试剂1ml,加入人EDTA或肝素抗凝血10μ,轻轻旋涡混匀,避免形成气泡,待溶血液的颜色由红色变为棕绿色后（大约1~2分钟）即可使用。此溶血液于15~25℃可稳定24小时,2~8℃可稳定24小时
根据不同型号生化分析仪及配套试剂设定参数,测定HbA1c浓度和测定Hb浓度。详细操作程序,必须根据仪器和配套试剂盒的说明书。