重组酶聚合酶扩增（Recombinase polymerase amplification reaction，RPA）

自20世纪90年代初以来，大量的等温核酸扩增方法涌现，有基于核酸序列的扩增（NASBA，又称转录介导扩增，TMA）、信号介导的核糖核酸扩增技术（SMART）、解旋酶依赖性扩增（HDA）、重组酶聚合酶扩增（RPA）、滚环扩增（RCA）、多重置换扩增（MDA）、环介导的等温扩增（LAMP）和链置换扩增（SDA）。其中RPA反应条件温和，扩增效率高，非常适合临床快速诊断、食品检测、疫情防控、工业应用、现场实时检测等应用。

1.简介

与PCR等温扩增方法相比，RPA具有操作简单、反应速度快、对设备要求低等优点。在灵敏度方面，RPA可以检测最低水平样品中的痕量核酸。在一些研究中，RPA甚至可以检测到PCR无法检测到的低浓度DNA。在特异性方面，RPA可以从不同物种和标本类型的基因组DNA中识别和扩增靶基因。RPA抗干扰能力强，检测结果可与PCR高度一致。此外，RPA可以在37-42°C下运行，无需复杂的温度控制设备，非常适合资源匮乏环境下的现场检测，并可以在20 min内得到检测结果，有利于样品的大规模筛选和快速检测。

2.反应机理

重组酶聚合酶扩增技术通过模拟DNA体内扩增，在等温条件下产生目的片段。该技术主要依赖重组酶、单链结合蛋白和链置换DNA聚合酶。重组酶能够不通过加热就解开双链DNA。重组酶聚合酶扩增反应开始时，重组酶在ATP的参与下结合引物，形成核酸蛋白复合体，这些复合体能够扫描与引物序列互补的目标双链DNA。接着，核酸蛋白复合体侵入5'端位点形成D状环。单链结合蛋白与被置换单链结合使其稳定。同时，重组酶离开寡核苷酸的3'端，降解后被DNA聚合酶利用。之后，链置换DNA聚合酶结合在核酸蛋白复合体的游离3'端，进行链延伸，形成新的互补链。在链延伸的过程中，新合成的单链与原始互补链配对。以上步骤循环进行，实现DNA的指数增长。

RPA-Fig1

Fig. 1 重组酶蛋白与每个引物形成复合物（A），扫描DNA的同源序列（B）。然后通过重组酶（C）的链置换活性将引物插入同源位点，单链结合蛋白稳定了置换的DNA链（D）。随后重组酶分解，引物3'端可进入置换DNA聚合酶（E）的链，从而延长引物（F），通过循环重复该过程实现了指数放大。

3.RPA检测的影响因素

RPA的突出之处源于其特定的反应成分和机理。RPA检测的细微差别取决于内在因素（如引物、探针和核酸模板的设计），并与外在因素有关（如反应温度和搅拌、对错配的耐受性、抑制剂和背景DNA）。此外，RPA过程中的核酸标记、RPA扩增产物的清理和扩增后处理也是实现RPA检测的重要细节。

3.1 RPA模板、引物、探针及其设计

RPA试验中DNA模板的GC含量应在40%-60%之间，并且应避免长同质聚合物轨道、少量直接/反向重复和回文序列；引物GC含量应在30%-70%之间，5′端应避免鸟嘌呤长迹，推荐胞苷类；引物3′端推荐添加鸟嘌呤和胞苷，以提高性能。此外需要避免引物和探针之间的重叠，减少对扩增效率的影响。

模板
RPA最初被证明是一种DNA核酸扩增方法，后来发现通过添加逆转录酶，RNA 也可以作为模板。无论和核酸模板类型如何，在试验中推荐RPA扩增子长度应低于500个核苷酸，大多数RPA扩增子长度在100到250个核苷酸之间，在此区间内会产生快速有效的扩增。
引物
与PCR不同，RPA引物的长度相对较长（建议至少为30个核苷酸，但通常在32至35个核苷酸之间）。较短的PCR引物（通常在18到25个核苷酸之间）也可以用于RPA反应，但可能会降低反应速度和灵敏度。
探针
TaqMan等传统探针不能用于RPA，PCR Taq聚合酶也与扩增系统不兼容，对于实时检测通常使用2种探头，RPA-exo或fpg。exo探针是一个长寡核苷酸（46-52个碱基），带有内部碱基类似物（如四氢呋喃，THF），位于荧光基团和淬灭剂之间，具有封闭的3'末端。非碱性残基用作酸外切酶的底物，只有在探针与靶序列结合后才能切割THF，荧光产生通常在RPA反应期间的5-10分钟内产生可检测的信号。与exo探针相比，fpg探针更短（32-35个碱基），它具有5′淬灭剂和下游5-6个碱基的荧光团，通过C-O-C接头连接到非碱性核苷酸的核糖上。fpg是一种8-氧鸟嘌呤DNA糖基化酶，它识别并切割荧光团，同时留下2个不可延伸的序列，是与核酸外切酶不同的催化模式。

3.2 温度和搅拌的影响

反应温度和反应过程中的搅拌是两个重要的外在影响因素。

温度

推荐的RPA反应温度在37-42℃之间，但在低至25℃的温度下，经过RPA放大和随后的侧流条带检测，仍然可以产生正信号。此外，环境温度对RPA反应也有影响，当环境温度低于10℃时，RPA反应不稳定，但延长反应时间可以提高阳性结果的可得性。
搅拌与震荡

反应温度为RPA中的酶提供了合适的工作环境，而搅拌则可以增加均质溶液反应中RPA组分之间的相互作用。建议对RPA反应执行两次混合步骤，一次在过程开始时，另一次在反应4分钟后。前者是混合所有RPA试剂来引发反应，后者是为了防止反应试剂局部耗尽，从而提高反应速率。
此外，在整个RPA反应过程中不断震荡混匀，可以进一步加快RPA反应速度，特别是当模板浓度接近检测极限时，可获得更稳定的阳性结果，提高灵敏度。

3.3 对错配、抑制剂和背景DNA的耐受性

除了温度和搅拌，对错配、抑制剂和背景DNA的耐受性也是实现高效、灵敏RPA反应的重要因素。

错配

RPA具有耐错配能力，引物5′端或中心的错配只会轻微地影响RPA反应，由于聚合酶从3′端延伸引物和探针，所以位于3′端的错配对反应有显著影响。然而，一般的RPA错配容忍度（在引物3′端之外）可能是有利的，因为它针对高度多态的靶标引物设计提供一定的灵活性。在高度多态的靶标中，很难定位长期保守的靶区，所以这种错配耐受性的缺点是倾向于对密切相关的物种进行非特异性检测。
抑制剂和背景DNA

在测试临床或现场样品时，可能会在样品制备和处理时引入干扰物质（如抑制剂），影响核酸扩增。研究表明RPA对一些聚合酶抑制物有耐受性，例如，当血红蛋白（20gL^-1）、肝素（0.5U）、尿液（1.25%)时对RPA反应无影响；但在十二烷基硫酸钠（0.05%/v/v）和尿液（10%）存在下反应被完全抑制，同时在模板浓度接近检测极限时，反应更容易受到抑制剂影响。除了对抑制剂的耐受性外，RPA还能够在背景DNA存在的情况下扩增靶核酸。

4.RPA的应用

4.1 细菌检测中的应用

基于RPA和侧向流试纸条的双重检测生物传感器来检测霍乱弧菌和创伤弧菌。该生物传感器具有灵敏度和特异性高、反应时间短、设备简单等优点，非常适合基层医院和现场检测。此外，用于检测铜绿假单胞菌和副溶血性弧菌的重组酶聚合酶扩增结合侧向流试纸条（RPA-LFS）也已经过实验验证。

4.2 在真菌检测中的应用

目前，医学上主要通过形态和生理表型对真菌进行检测。此方法检测时间长，阳性检出率低。例如新型隐球菌是一种有条件的病原体，大多数患者有中枢神经系统感染症状，死亡率高。检测新型隐球菌的常用方法是墨水染色和病原体培养。培养法是检测的金标准，但培养时间长不利于临床快速诊断。墨迹染色法受试样类型限制，阳性检出率低。基于这种情况建立了用于目视快速检测新型隐球菌/格特隐球菌的RPA-LFS。

4.3 在病毒检测中的应用

逆转录重组酶聚合酶扩增（RT-RPA）和RPA-LFS方法比RPA-CRISPR更早应用，也广泛用于病毒检测。RPA-LFS还可以联合检测流行性出血性疾病病毒、血清型病毒和呼吸道合胞病毒。由于一些病毒（如胡椒黄斑病毒）在其复制周期中具有两个阶段的DNA和RNA，建立了RPA和RT-RPA来检测病毒。RPA在病毒检测中的应用往往首先需要逆转录。如果将逆转录和RPA扩增分为两个步骤，则气溶胶产生和污染的风险增加。

4.4 在寄生虫检测中的应用

RPA和实时荧光的结合允许实时检测过程，并且比RPA-LFS具有更低的交叉污染风险。RT-RPA还可以针对不同寄生虫的特定基因设计引物探针，以建立多个RT-RPA。目前多个RT-RPA已成功应用于同时快速检测马泰勒氏菌和卡巴利巴贝虫。除了传统的荧光探针外，荧光染料SYBR Green I与RPA相结合也常用于检测寄生虫，例如诺氏疟原虫。RPA已成功应用于检测许多寄生虫，但应用尚未广泛。目前的研究大多是相对简单的RPA-LFS、实时荧光RPA等，RPA与其他方法相结合的进一步研究相对较少。

4.5 在耐药基因检测中的应用

抗生素的过度使用会导致细菌耐药，给临床疾病的诊断和治疗带来巨大挑战。细菌耐药监测对指导临床用药、避免或延缓耐药菌株的产生具有重要意义，RPA的快速、高效、简单优势在抗性基因检测中发挥着重要作用。RPA具有与PCR相当的检测能力，有时其灵敏度甚至高于PCR。

4.6 在转基因食品检测中的应用

目前，基于蛋白质水平和核酸水平检测转基因作物的方法主要有两种。前者受蛋白质变性、检测试剂等原因的限制，无法满足大规模转基因作物的检测。后者的PCR方法具有较高的灵敏度和特异性，但PCR需要复杂且昂贵的热循环仪器，操作流程复杂，不适合现场检测。建立快速便捷的检测方法将大大提高转基因食品的检测效率。RPA方便高效，非常适合基层单位、仓库、田间现场转基因检测。然而，只有少数公司销售RPA试剂，这限制了其在转基因食品大规模筛选中的应用。

4.7 在SARS-CoV-2检测中的应用

当前检测SARS-CoV-2的主要方法包括实时荧光定量PCR（qRT-PCR）、数字PCR和各种等温扩增方法。其中，RT-qPCR是应用最广泛的方法，但对设备、检测条件、人员操作要求较高。通过将RPA和LFS检测系统集成到单个微流控芯片中，建立了用于快速检测SARS-CoV-2的微流控集成侧流RPA。封闭的微流控芯片克服了气溶胶污染，简便的分析系统降低了设备成本和人工成本。RPA还可以通过添加荧光染料SYBR Green I实时或在终点检测SARS-CoV-2，不需要打开管子，避免气溶胶污染，并可用肉眼观察测试结果，且成本也低于RPA-LFS和RT-RPA。RPA对设备和现场检测环境要求较低，非常适合SARS-CoV-2的现场筛查。

参考文献

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